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1、Outline,Background Hallmarks of Cancer The Bcl-2 Protein Family Model of BH3 mimetic-induced apoptosis Structure basis for designing ligands Small molecule inhibitors Peptidomimetic approach mimic the a-helix of the BH3 peptides ABT-737, ABT-263 and their analogs pan-active inhibitor of Bcl-2 Select
2、ive Bcl-2 inhibitors selective BCL-xL inhibitor Selective Mcl-1 inhibitors,1,Cell,144(5): 646-674,Hallmarks of Cancer,2,Extrinsic and intrinsic pathways of apoptosis,Expert Opin. Ther. Patents (2012) ,22(1):37-55,3,The Bcl-2 Protein Family,The Bcl-2 Family Proteins with anti- or pro-apoptotic functi
3、on Characteristics: (Often) a C-terminal transmembrane domain. Bcl-2 homology (BH) domains. Bcl-2 proteins form homo- and heterodimers via their BH-domains,BH1, BH2: Predicted to form ion channels BH3: The ”suicide domain” regulates cell death BH4: Thought to confer anti-apoptotic activity.,(Chan &
4、Yu. (2004). Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31: 119). Chipuk, J. E，Molecular Cell ，2010，37(3): 299-310,4,Elevated of Bcl-2 or Bcl-xL expression,Seminars in Oncology, 2004,30(Supplement 16): 133-142.,5,Model of BH3 mimetic-induced apoptosis,一、直接模型： 抑制剂代替促凋亡蛋白BAK/BAX，与抗凋亡蛋白Bcl-2/Bcl-xl结合，从而抑制后者，促进细胞凋亡
5、二、间接模型 抑制剂替代特定的激活因子BH3-only蛋白，与抗调亡蛋白如BCL-2/BCL-xL结合，游离出来的BH3-only蛋白，激活BAK/BAX。,Nature Reviews Drug Discovery 2008，7(12): 989-1000 Clinical Cancer Research 2009，15(4): 1126-1132. Oncogene ，2009，27(S1): S149-S157.,6,Structure basis for designing ligands,7,The molecular basis for heterodimer formation,
6、Heterodimerization between members of the Bcl-2 family of proteins is a key event in the regulation of apoptosis pro-apoptotic protein(Bak) adopts an amphipathic a- helix(BH3 domain) that interacts with anti-apoptotic proteins(Bcl-xl) through hydrophobic and electrostatic interactions in the hydroph
7、obic cleft.,8,抗凋亡蛋白(BCL-2)是通过其表面疏水凹槽与促凋亡类(BIM)的 BH3区域结合发生相互作用，调节细胞正常的生理凋亡。,BCL-2 family antagonists for cancer therapy. Nature Reviews Drug Discovery 2008，7(12): 989-1000,Overlay of BCL-XLABT-737 complex with BCL-xlLBIM BH3 complex,Bcl-2 and BIM BH3,9,Bcl-xL and Bak-BH3,Surface representation of the
8、 binding pocket of Bcl-xL bound to the Bak peptide,10,. “Structure of Bcl-xL-Bak Peptide Complex: Recognition Between Regulators of Apoptosis.“ Science 1997，275(5302): 983-986.,Bcl-xL-Bim BH3,Mcl-1Bim BH3,Bcl-xL/Bad,Protein Science ,2000, 9:25282534,11,5个疏水中心 (P1, P2, P3, P4和P5) 4个氢键供体 (D1, D2, D3和
9、D4) 2个氢键受体 (A1 and A2),Bcl-2活性部位分布图,在受体D1、D2、D3、A1位点出现比较频繁，与受体形成静电作用能提高亲和力与特异性 D4，A2位点出现频率较小，能量贡献不大,BMC，2007， 15(19): 6407-6417,Small molecule inhibitors,Peptidomimetic approach mimic the a-helix of the BH3 peptides ABT-737, ABT-263 and their analogs pan-active inhibitor of Bcl-2 Selective Bcl-2 inh
10、ibitors selective BCL-xL inhibitor Selective Mcl-1 inhibitors,13,Bak,Peptidomimetic approach mimic the a-helix of the BH3 peptides,JACS,2005,127(29): 10191-10196 JACS,2005,127(15): 5,463-5468,14,J Biol Chem. 2011 ,18; 286(11): 93829392,Organic Letters,2007, 9(19): 3733-3736.,Bim BH3 a-helix,J. Med.
11、Chem. 2012, 55, 1073510741,15,ABT-737, ABT-263 and their analogs,16,SAR by NMR与ABT-737系列的发现,SAR by NMR（由Shuker小组开发）：通过NMR技术将合理性药物设计和非合理性药物设计(组合化学)巧妙地结合起来，产生了一种极为有效的发现药物靶分子高亲和性配体的方法。 步骤：1、筛选出一个和15N标记的靶蛋白结合的小分子 2、对第一个小分子类似物进行筛选， 通过结构与活性的关系进行优化。 3、用同样的方法得到与第二个位点结合的 第二个小分子，并对其筛选、优化。并用多维NMR技术测定 蛋白质和两个配体的
12、复合物的完整三维空间结构，得到两个 配体在靶蛋白上确切的结合位置及其空间取向。,3.Screen for second ligand,2D 1H-15N HSQC谱中蛋白的H1或N15化学位移变化。,17,Science. 1996 Nov 29;274(5292):1531-4.,4.基于上述三维结构设计恰当的连接桥将两个片段连接起来，使得到的分子和靶蛋白结合时保持各自独立时的结合位置及其空间取向，最终筛选得到一个高亲和性的配体. 特点：首先筛选结合于生物靶分子亚活性位点的低亲和性配体，然后通过优化和组装便得到所期望的高亲和性配体。 优点：NMR实验方法来辨别小分子和靶蛋白的结合，能快速地从
13、小分子化合物库中发现结合于靶蛋白亚活性位点的低亲和性配体。如Fesik等筛选溶基质素(stromelysin)的抑制剂只用了半年时间。 限制：知道靶蛋白确切的NMR三维结构、提供足够量的15N标记的靶蛋白(200mg) （25 kDa） 、解析蛋白质三维结构的能力。,Link ligands,连接基团成功的关键是连接桥的长度及其性质（如刚性）,Science 274, 1531-1534 (1996),18,ABT-737系列的发现过程,1.为BCL-xL筛选第一个配体。 从平均分子量为200Da的10 000个化合物片段库中筛选出来1,黑：HSQC of 15N-Bcl-xL,红：HSQC
14、of 15N-Bcl-xL with biaryl acid（ 1 ）,1的羧基能与R139结合，相当与Bcl-XlBak复合物中的D83,19,Site1: Tyr 101, Leu 108, Val 126 and Phe 146,20,2.筛选第二个配体,从平均分子量为125Da的3500个化合物中筛选出11,黑: HSQC of 15N-Bcl-xL. 红: HSQC of 15N-Bcl-xL with biaryl acid (1). 绿: HSQC of 15N-Bcl-xL with napthol (11).,21,连接方式,25的活性比1提高了大概200倍，但溶解度不好,1
15、1,22,J Med Chem 49, 656-663 (2006),联苯替代Bak-BH3的V74、Leu78 硝基苯替代Ile85 酰基磺胺上O与R139接近，替代Bak的Asp83 并且两个芳环与Y194，F97重叠，形成疏水性的 stacking作用,Site 2,23,A-385358,31,不幸的是，31在HSA存在情况下与Bcl-Xl 结合大大下降。它能与HSA的domain III 紧密结合。,J. Med. Chem.2006,49,1165-1181,68倍的失活,Bcl-xL Ki 1nM Bcl-xL Ki 10% HS:35nM,24,增加site1的极性,ABT-2
16、63-口服小分子抑制剂,1，改变叔胺的pka，显著增加口服吸收。 (pKa 7.5）用弱碱性的吗啉取代。 2，芳硝基在体内能产生毒性代谢物。 3，4-氯联苯部分发生氧化代谢。,ABT-737,ABT-263 MW:974,Pka10,J. Med. Chem.2008,51,69026915 Nature Reviews Drug Discovery 2008，7(12): 989-1000,25,MW：813.43,ABT-737/ABT-263类似物（以结构为基础的药物设计）,喹唑啉类,JACS. 2006,128, 16206-16212 J. Med. Chem.2011, 54,19
17、141926 J. Med. Chem.2012, 55, 46644682 J. Med. Chem.2012, 55, 61496161 J. Med. Chem.2012, 55, 85028514 J. Med. Chem.2013, 56, 30483067,4,5-二苯基吡唑类,Bcl-2/Bcl-xL:Ki1 nM,A,Optimization,BM-957,26,27,总结,1、ABT-737/ABT-263打破了lipinsks rule of five。 一方面是由于雅培公司研究人员用SAR by NMR，平行合成，基于结构药物设计多种方式设计小分子抑制剂；另一方面，对小分
18、子与受体结合模式的进行双向研究，相互理解。 2、对研究者研究Bcl-2家族蛋白，及设计小分子抑制剂有很好的指导作用：BCl-2/BCl-Xl三维结构的理解、 SAR by NMR、Structure-Based Design，FBDD等。,28,pan-active inhibitor of Bcl-2,29,Obatoclax,Phase II,AT-101,Phase II/III,早期研发的抗凋亡蛋白小分子抑制剂基本上都是pan-Bcl-2 antagonist 包括三联苯类， HA-14-1及其类似物，棉酚及其衍生物，BH3I及其衍生物等,BH3I-1,S1,DCBL55,Journa
19、l of Medicinal Chemistry,2010,53(9): 3465-3479 Nature Reviews Drug Discovery ,2008,7(12): 989-1000,30,ABT-199 Selectively Kills BCL-2-Dependent Tumor Cells While Sparing Platelets (A) Navitoclax (ABT-263) binds with high affinity to both BCL-2 and BCL-XL. Because many tumors, particularly lymphoid m
20、alignancies, are addicted to BCL-2 for survival,.,Cancer Cell , 2013,23(2),139 - 141,ABT-199：Selective Bcl-2 inhibitor,31,Nature medicine,2013,19(2):202-8,BCL-2 Ki 0.010 nM BCL-XL Ki = 48 nM BCL-W Ki = 245 nM,Phase I/II,Phase I,32,化合物1与Bcl-2,化合物2与Bcl-2,化合物1与Bcl-2的晶体复合物中 发现1与一个 Bcl-2结合时，另外 一个Bcl-2的Tr
21、p30的吲哚环会插入P4位点 与Asp103形成氢键。 同时产生-stacking作用 而Asp103相当于Bcl-xl的GLu96。,33,其它,YC137,34,WEHI-539 :a selective BCL-XL inhibitor,Nature Chemical Biology 9, 390397 (2013),benzothiazole-hydrazone scaffold,P2,P4,苯并噻唑腙深入P2位点里面，并与Ser106,Leu108形成氢键作用 羧基与Arg139结合，形成氢键作用 苄胺在P4位点，并且紧密贴合。 氨基与GLu96有静电作用 WEHI-539替代Phe
22、105,使得P2疏水口袋更深（ABT-737）。P2具有可塑性。,P4,BCL-XL：IC50= 1.1 nM 选择性：500-fold over BCL-2 400-fold over BCL-W, MCL-1,Arg139,Phe105,Tyr195,35,Glu96,2.2 M,0.77 M,1,2,化合物活性虽未提高，但晶体复合物发现，苯并噻唑腙深入P2位点里面，贴合紧密， 并且与Ser106,Leu108形成氢键。 酰基磺胺与Arg139的胍基相互作用,36,优化,37,WEHI-539,Selective Mcl-1 inhibitor,Marinopyrrole A,J Biol
23、 Chem. 2012 , 287：10224-10235 J. Med. Chem.2013, 56, 1530 WO2013052943A2,Ki：0.32M,10M,UMI-77,Ki：0.49M,38,小结,由肿瘤细胞的十大特征引出细胞凋亡及Bcl-2蛋白家族。 以Bcl-2蛋白家族为靶点的设计小分子抑制剂的结构基础。 一些小分子抑制剂 药化概念： SAR by NMR，平行合成， Structure-Based Design，Fragment Based Drug Design， high throughput screening,39,Thanks for your attention!,40,