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1、表1 胞内酶举例,细胞破碎的必要性,表2 几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物,细胞壁的组成与结构,图1 革兰氏菌细胞壁结构图 （a）革兰氏阳性菌 （b）革兰氏阴性菌,图2 酵母细胞壁的结构示意图 M甘露聚糖； P磷酸二酯键； G葡聚糖,微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。 内因：连接细胞壁网状结构的共价键。 外因：各类微生物的遗传信息、培养条件、菌龄、外界环境等。,破碎程度的评价,破碎程度常用细胞破碎率（%）表示。 破碎率定义为被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即： Y（%）=（N0-N）/N0*100 其中N0原始细胞数量； N 经t时间操作后保留下来
2、的未损害完整细胞数量。,N0和N的确定方法： 直接计数法：通过平板计数技术或血球细胞器上用显微镜观察，直接对适当稀释后的样品进行计数。 间接计数法：在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（eg.可溶性蛋白、酶等）。,细胞破碎技术,其他新的细胞破碎方法：,激光破碎法 冷冻-喷射法 高速相向流撞击法,表3 细胞对破碎的敏感度,注：上述数字表示相对敏感度，括号则表示数字不确切。,常用的破壁方法,珠磨法,高压匀浆法,超声波破碎法,X-press法,机械法,非机械法,酶溶法,化学渗透法,渗透压法,冻结融化法,干燥法,常用的破壁方法珠磨法,作用机理：固体剪切作用,图3 水平搅拌式珠麿机结构示意
3、图 1细胞悬浮液 2细胞匀浆液 3珠液分离器 4冷却液出口 5搅拌电机 6冷却液进口 7搅拌桨 8玻璃珠,破碎作用遵循一级动力学定律：,破碎的速率和效率是所有操作参数的函数，如：珠体的大小、珠体的装量、细胞浓度、操作温度、料液性质、搅拌器转速与构型等。 此外，与搅拌器的设计和研磨腔的结构也有关系，如转盘外缘速度等。,一般来说，磨珠越小，细胞破碎速度越快，但太小易于漂浮，并难以保留在研磨机的腔体中。通常实验室规模，珠体直径为0.2mm较好，工业规模不得小于0.4mm。 不同的细胞类别及所需提取的酶在细胞中的位置等也是应考虑的因素。,有研究表明，减小磨珠直径起先会提高卡乐酵母蛋白质的释放速度，但磨
4、珠再小一些，蛋白质的释放速度反而稍有下降。 eg.从酵母细胞中提取D-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，最好使用0.55-0.85mm大小的玻璃珠，而在提取-D-葡萄糖苷酶时，则最好使用较大尺寸（如1mm直径）磨珠。,在一定范围内，增加珠体装填量可以提高细胞破碎率。但超过某一限度时，反不利于细胞破碎和蛋白质的释放。 为消除这种影响，必须提高搅拌器的功率，这样又会增大释放的热量，给破碎带来困难。 一般研磨机腔体内的填充密度控制在80%-90%，并随珠体大小变化。,细胞浓度对悬浮液的流变特性具有影响，最佳的细胞浓度应用实验来确定。一般用Netzsch LM20研磨机破碎时，细胞浓度控制在40%左右。,Cur
5、rie等人的研究表明，操作温度控制在5-400C范围内对破碎物的影响较小。 常采用冷却夹套和搅拌轴的方式来调节磨室的温度。,作用机理：液体剪切作用,常用的破壁方法高压匀浆,图5 高压匀浆机装置图,此方法中影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器的次数。 有研究表明，当悬浮液中酵母浓度在450-750kg/m3时，温度由500C提高到300C，破碎率约提高1.5倍。,图7 细胞浓度及压力大小对破碎率的影响,匀浆次数,图8 匀浆次数对破碎效果的影响,常用的破壁方法超声波破碎,作用机理：空化现象,由无数细小的空化气泡破裂而产生的冲击波的现象。,超声波振动在液体中传播的音波压强达到1atm时，功率密
6、度为0.35 w/cm2，这时超声波的音波压强峰值可达真空或负压，但实际上无负压存在，因此在液体中产生一个很大的力，将液体分子拉裂成空洞一空化核。此空洞非常接近真空，在超声波压强反向达到最大时破裂。,图10 USB600型微电脑控制超声波细胞粉碎机,图9 超声波细胞破碎仪的结构示意图,振幅 细胞悬浮液的黏度 表面张力 被处理悬浮液的体积 珠粒的体积和直径 探头的形状和材料 细胞悬浮液的流速,影响参数,常用酶： 溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、 -1,6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等。,常用的破壁方法酶溶法,作用机理： 利用酶分解细胞壁上特殊的化学键。,eg. 蜗牛酶从
7、蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种。,在某些情况下，不加外源酶也可使某些微生物发生自溶。 eg.谷氨酸生产菌（如乳糖发酵短杆菌） 加入pH10的缓冲液（0.028mol/LNa2CO3 0.018mol/LNaHCO3 ），配3%的细胞悬浮液，加热至700C，保温搅拌20min，菌体即自溶。,所用的化学试剂：酸、碱、表面活性剂、脂溶性有机溶剂、EDTA鳌合剂、变性剂等。,常用的破壁方法化学渗透法,作用机理：改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来。,酸、碱：用来调节溶液的pH值，改变细胞所处环境，改变蛋白质的电荷性。 有机溶剂：常用的
8、是甲苯，被细胞壁脂质层吸收后导致胞壁膨胀，造成细胞壁破裂。此外，丁醇、丙酮、氯仿等也常用到。,表面活性剂：天然的如胆酸盐、磷酯，合成的如SDS、Tween、TritonX-100等。 变性剂：如盐酸胍，与水中氢键作用，消弱溶质分子间的疏水作用。,eg.1. 某些动物细胞（肿瘤细胞）可采用SDS、去氧胆酸钠等破坏细胞膜；而细胞壁较厚，采用溶菌酶处理效果较好。 2. 用Triton从一种诺卡氏菌中选择性地提取胆固醇氧化酶。,温和化学渗透剂,温和化学渗透剂一般是采用甘氨酸、丙氨酸等分子量较小的非极性基氨基酸。 其破碎机理可能是因为小分子的甘氨酸、丙氨酸更易渗透到细胞壁中,通过氢键、范德华引力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构,从而改变细胞壁和细胞膜的通透性。,表4 不同细胞可采用的化学渗透处理方式,* 表示适用,表5 机械破碎法与非机械破碎法的比较,细胞破壁技术注意事项,多种破碎方法相结合 与下游过程相结合 与上游过程相结合,本章小结,细胞破碎主要方法,细胞破碎机理图,思考: 1、微生物细胞破碎的原因是什么？有哪些具体的方法？ 2、G+菌、G菌以及酵母菌细胞壁的差别在哪里？ 3、请指出珠磨法与高压匀浆法各自的原理及适用范围。 4、细胞破壁应注意哪些问题？,