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1、药品生物检定技术-利用生物体（微生物、细胞、离体组织或动物）对药物的特定药性、毒性作用，来测定生物药品的效价，检查药品中的有害物质以及对制剂进行微生物限度、无菌检查的技术方法。,第一节 无菌检查 无菌检查法-检查药品 、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 它是判断供试品是否被微生物污染的一种方法。,一、技术要求： 纯净度10000级的局部纯净度100级单向流空气区域内。 全过程无菌操作。 单向空气区、工作台面、环境符合国家相关标准。,二 . 培养基（Medium） 1、培养基：是供微生物、植物、动物组织生长 和维持用的人工配制的养料（营养物质） 保存： 保存于2-25。 应防潮
2、、避光、阴凉处保存 碳水化合物、含N物、无机盐 一般含有： 维生素、H2O 、 抗菌素、色素,2、种类 硫乙醇酸盐流体培养基：需氧菌、厌氧菌培养基 改良马丁培养基：（真菌培养基） 选择性培养基 对氨基苯甲酸培养基（磺胺类） 聚山梨酯80（非水溶性供试品） 营养肉汤培养基 营养琼脂培养基： 0.5%葡萄糖肉汤培养基： 改良马丁琼脂培养基：,聚山梨酯80（20，40，60，65，80，85） （吐温80） tween 80： 0 / W 脂肪酸山梨坦（20，40，60，65，80） （司 盘） Span ： W / 0 亲水，亲油基团的表示方法,3、培养基的适用性检查： 无菌检查： 随机抽 5瓶（
3、或支） 生长 14天，应无菌 灵敏度证明所加的菌种能够在培养基 中生长良好 。 三.方法验证试验： 正式测定之前，需要先测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用、避免假阴性出现。,（四）无菌检查法： 1、检查数量：指一次试验所用供试品最 小包装容器的数量。 例：2支（瓶）/2板12粒 检查量：指一次试验所用供试品的总量 （g 或 ML） 例： 210=20ML 240.25=6g 2、对照试验： 阳性对照 阴性对照,3、检查方法： a、薄膜过滤法：应用广、准确性高，适用 于任何药品、尤其是具有抑菌作用的。 b、直接接种法：操作简便，适用于无 抑菌 作用的供试品。 （2）培养观察：培养14天，无细菌
4、生长。,（五）结果判断： 1、若澄清， 无菌 符合规定 虽浑浊，但无菌 符合规定 2、任一管浑浊有菌生长 不符合 3、若试验无效 重试,第二节 微生物限度检查 目的： 判断药品被污染的程度，细菌数 越多药品受污染大 安全性越差。 1. 定义检查非规定灭菌制剂及其原料，辅料受微生物污染程度的方法。 项目包括：细菌数、 真菌数、 酵母菌数、控制菌数。,2、技术要求： 结净度10000级以下 区域、工作台、环境符合国家标准 加入辅料（表面活性剂、中和剂、灭活剂）- 证明其对微生物生长存活无影响 30-35（细菌） 23-28 （真菌、酵母菌） 35-37 （控制菌） 结果报告以1g、1mL、10g、
5、10mL、10 Cm2,3、检验量：一次试验所用供试品的量 （g、ml、cm2） 一般供试品为：10g、10mL。 化学膜剂：100 cm2 中药膜剂：50cm2 4、供试品制备：按照药典规定制备,5、菌种： A.细、真、酵 ，对照试验菌种 ： 大肠埃希菌、 金葡菌、枯草、白色念朱菌、黑曲霉 B.控制菌，对照试验菌种：大肠、金菌、乙型 副伤寒、铜绿假单胞菌、芽孢梭菌 传代次 数： 5 代。 6、培养基：制备的灭菌条件：121 20min 7、方法验证 ： 确证所用方法适于该菌的计数检查,8、方法： （1）细、真、酵： 测药物在单位质量 （体积）内所存在的活菌数量。 评价生产过程中原辅料设备、器
6、具 工艺、环境、操作者的卫生状况。 （2）方法： 平 皿 法： 法定方法、最常用 薄膜过滤法：,（3）控制菌 大肠埃希菌：是粪便污染的指标菌 大肠菌群：是药品、食品、饮水等的卫生 指标菌 沙门菌： 是人畜共患的肠道病原菌，引起伤 寒、肠炎、食物中毒 铜绿假单胞菌：烧伤、烫伤、眼科、外科 ， 引起化脓性感染 金葡菌 ： 化脓 梭菌： 破伤风、肉毒素,第三节 抗生素效价的微生物检定法 一、管碟法： 1、定义： 利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用 比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产 生抑菌圈的大小 以 测定供试品效价的一种方 法。,2、方法 A. 二剂量法： 碟4 2个 高：低（供试品） 剂距
7、2：1 或 4：1 2个 高：低（对照品） B. 三剂量法：碟6个 3个 高：中：低 （供试品） 剂距 1：0.8 3个 高：中：低（对照品）,二、浊度法 标准曲线法 二剂量法 三剂量法,防病、治病的 三大药源,第四节 生化药物的效价测定法 P 257,一、生物药物 利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理和方法制备的一大类药物。,包括： 生化药物、生物合成药物、生物制品。,*（一）生化药物（biochemical drugs） 从动物、植物及微生物中提取的，用 生物化学半合成制备的或用现代生物技术制得的具有生物化学活性的物质及其衍生物
8、、降解物以及大分子的结构修饰物等。,二、生物药物的分类,生化药物： 例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。,* * 2. 基因工程药物-采用现代生物基因技术，借助某些微生物、动、植物来生产出所需的药品。 基因工程 生物工程 细胞工程 酶工程,应用前景： 方便临床用药； 弥补某些药物的市场空缺； 有利于临床治疗； 有利于人类健康。 前景非常广阔,*种类： 1. 氨基酸、多肽与蛋白质类 2.药用 酶类与辅酶类 3. 多糖类 4. 脂质类 5. 核酸及其降解物和衍生物类药物,常见生化药物： 复合氨基酸、脑多肽、牛纤维蛋白原、水蛭素、生长素、催乳素、天花粉蛋白、辅酶Q10、蛋白水解酶、凝血酶、肝素、硫酸软骨
9、素A、灵芝多糖、透明质酸、黄芪多糖、人参多糖、胆酸类、RNA、DNA、ATP、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、阿糖腺苷、环胞苷等。,门冬酰胺酶（抗肿瘤药） Ch.P（2005）二部 本品系自埃希大肠杆菌（E.coli ASI.357） 或欧文菌（Er-winia casotovora）中提取制备的 具有酰氨基水解作用的酶。,肝素钠（抗凝血药） Ch.P（2005）二部 本品系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨 基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质。,门冬酰胺（氨基酸类药） Ch.P（2005） 本品为门冬酰胺一水合物。按干燥 品计算，含C4H7NO4不得少于98.5%。,生物合成药物是由微生物代谢所产生的药
10、物和必须利用微生物及其酶转化反应共同完成的半合成药物，如抗生素,（二）生物合成药物（biosynthetic drugs）,（三）生物制品（biological products） 是以微生物、细胞、动物或人源组织 和体液等为原料，运用传统技术或现代生 物技术制成，用于人类疾病预防、治 疗和诊断的药品。,收载在中国药典（2010年版）第三部,生物制品主要有疫苗、免疫血清、血液制剂、免疫调节剂（胸腺肽、免疫核糖核酸）和诊断试剂。,三、生物制品的种类和特点,（一）种类 1. 疫苗类 细菌类疫苗 （狂犬疫苗、卡介苗） 病毒类疫苗 （麻疹减毒活疫苗） 联合疫苗 双价疫苗及多价疫苗,2. 抗毒素及抗血清
11、类药物 3. 血液制品 由健康人的血液或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分统称为血液制品，主要用于临床治疗和被动免疫预防，如人免疫球蛋白,4. 重组DNA制品 采用遗传修饰，将所需制品的编码DNA通过一种质粒或病毒载体，引入适宜的微生物或细胞系，DNA通过表达和翻译后成为蛋白质，再经提取和纯化而回收所需制品制得。包括： 细胞因子类（重组人干扰素） 生长因子类（重组人表皮生长因子） 激素类（重组人胰岛素） 酶类（重组链激酶） 疫苗（重组乙型肝炎疫苗） 单克隆抗体,37,重组DNA技术,38,国外重组DNA制品,中文名称 英文名或缩写 适应症
12、 胰岛素 Humulin Novolin Humalog 糖尿病 肿瘤坏死因子 TNF 各种肿瘤 集落刺激因子 Neupogen 人生长激素 Protropin Humatrope NutropinAQ 矮小病 人干扰素 rhuIFN2b rhuIFN2a rhuIFNB 抗癌 rhuIFNrlb HCV, 抗癌 HBV,HVC等 抗癌，多发硬化症肾癌，慢性肉芽肿 白细胞介素 rhuIL 化疗，抗癌 组织溶纤原激活剂 RhuTpA 脑栓塞，心梗,39,我国重组DNA制品,中文名称 英文名或缩写 适应症 重组人干扰素a1b rhuIFNaIb 治疗病毒性角膜炎 上皮生长因子 (EGF) 烧伤或创
13、伤治疗外用药物 粒细胞集落刺激因子 (GCSF) 癌症 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 癌症治疗引起的白细胞减少症 红细胞生成素 (EPO) 治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血 溶栓药物链激酶 (SK) 治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血 重组人胰岛素 Humulin Novolin Humalog 糖尿病 白细胞介素-2 rhuIL-2 类风湿,5. 诊断制品 体外诊断制品 体内诊断制品 6. 其他制品（如胃蛋白酶）,*（二）生化药物的特点 1. 分子量大、不是定值 2. 结构确认难 ，需采用生化法确证 3. 需检查生物活性 4. 要求检查安全性 5. 需做效价测定,1. 分子量大、不是定
14、值,肝素 1200015000（未分级） 低分子肝素 8000 （低分子量）,重组人胰岛素 5807.89,腺苷钴胺 1579.60,右旋糖苷70 64000 76000,不定值,测定困难,抗凝血,抗血栓,2. 结构确认难 ，需采用生化法确证,理化方法 生化方法 氨基酸序列分析 肽图,例 重组人粒细胞刺激因子注射液 Ch.P（2005） 3.1 原液检定 3.1.12 肽图（至少每半年测定1次） 依法测定（附录 E），应与对照品图形一致。 3.1.13 N-末端氨基酸序列（至少每年测定1次） 用氨基酸序列分析仪测定，其N-末端序列应为： Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-
15、Ser-Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu-Leu。,3. 需检查生物活性,例 细胞色素C溶液 Ch.P（2005） 【检查】活力 照细胞色素C活力测定 法（附录 B）测定，不得低于95.0%。,例 尿激酶 Ch.P（2005） 【检查】凝血质样活性物质 凝血质样活性为零值时的供试品酶活力，按每1ml中供试品的单位表示，每1ml应大于150单位。,4. 要求检查安全性,例 重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞） Ch.P（2005） 制造 细胞外源因子检查：细菌和真菌、支原体、细胞病毒外源因子检查均应为阴性。 检定 原液检定 牛血清白蛋白残留量，CHO细胞DNA残留量，CHO细胞蛋白残留量
16、，无菌检查，支原体检查 半成品检定 无菌检查，细菌内毒素检查 成品检定 无菌检查，异常毒性检查，细菌内毒素检查,5. 需做效价测定,例 门冬酰胺酶 Ch.P（2005） 按干燥品计算，每1mg蛋白含门冬酰胺酶效 价不得低于250单位。,例 肝素钠 Ch.P（2005） 【效价测定】照肝素生物测定法（附录 D）测定，应符合规定；测得的结果应为标示量的91%110%。,四、生物制品的全程、全面质量控制 生物制品多数为生物活性分子，对人体而言往往是异源物质，其化学性质与生物学性质都很不稳定，又易受到微生物污染，故对生物制品的均一性、有效性、安全性和稳定性等都有严格要求。为了生产出药理活性高、针对性强
17、、毒性低、副作用小、疗效可靠及营养价值高的生物制品，必须对其原材料、生产过程和最终产品进行全程质量控制。,* 一、鉴别方法： 理化鉴别法：化学鉴别法 紫外分光光度法 HPLC法 生化鉴别法：酶法 电泳法 等电聚焦法 生物鉴别法：家兔惊厥试验,（一）理化鉴别法 1.化学鉴别法： 例：溶菌酶 - CONH- +Cu2+ 络合显色,胃蛋白酶 Ch.P（2005） 【鉴别】取本品的水溶液，加鞣酸、没食 子酸或多数重金属盐的溶液，即生成沉淀,谷氨酸钠 Ch.P（2005） 【鉴别】（1）取本品约5mg，加水1ml使 溶解，加茚三酮试液数滴，加热，溶液显 蓝色至紫蓝色。,2. 紫外分光光度法,腺苷钴胺 C
18、h.P（2005） （1）氯化钾溶液中：max在264nm、285nm、305nm及460nm （2）磷酸盐缓冲液（pH7.0）中， max在261nm、525nm,3. 高效液相色谱法,重组人胰岛素 Ch.P（2005） 【鉴别】 在效价测定项下记录的色谱 图中，供试品溶液主峰的保留时间应与 对照品溶液主峰的保留时间一致。,1. 酶法 高效、专一的催化某些生化反应。 如尿激酶的鉴别。,（二）生化鉴别法,尿激酶 本品系从新鲜人尿中提取的一种能激活纤维蛋白溶酶原的酶。它是由高分子量尿激酶（Mw 54 000）和低分子量尿激酶（Mw33 000）组成的混合物，高分子量尿激酶含量不得少于90，每1m
19、g 蛋白中尿激酶活力不得少于12万单位。 本品在生产过程中需经60加热10小时，以使病毒灭活。,【鉴别】 取效价测定项下的供试品溶液，用巴比妥氯化钠缓冲液（pH 7.8）稀释成每1ml 中含20单位的溶液，吸取1ml ，加牛纤维蛋白原溶液0.3ml ，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液0.2ml ，牛凝血酶溶液0.2ml ，迅速摇匀，立即置370.5恒温水浴中保温，记时，反应系统应在3045秒内凝结，且凝块在15分钟内重新溶解。以0.9氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在2 小时内不溶（试剂的配制同效价测定）。,牛纤维蛋白酶,+,溶解,2. 电泳法,例 肝素钠 Ch.P（2005） 【鉴别】（1）取
20、本品与肝素标准品，分别加水制成每1ml中含2.5mg的溶液，照电泳法（附录F第三法）试验，供试品和标准品所显斑点的迁移距离之比应为0.91.1。,三、生物鉴别法,血清学法 体外抗原抗体试验 2. 生物学法 利用生物体对药物的反应来鉴别药物 如 ：利用小鼠的惊厥反应来鉴别胰岛素,利用胰岛素的降糖作用。 给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50% GS，惊厥停止。,第五节 药品的安全性检查 P258,一、特殊杂质检查,1. 宿主细胞（菌）蛋白残留量的检查,2. 外源性DNA残留量的检查,3. 产品相关杂质的检查,4. 残余抗生素的检查,二、安全性检查,1. 热原检查,家兔法: 观察体温升高情
21、况,2. 细菌内毒素检查 鲎试剂 方法 : 凝胶法 光度测定法,鲎试剂法 (简单、快捷、灵敏、准确） 大多数重组产品具有很高的生物活性，特别是细胞因子类产品本身就有很强的致热原作用，因此采用细菌内毒素检查代替热原检查。,3. 异常毒性检查与特异性毒性检查,使动物急性中毒死亡的物质的限量检查。 以动物死亡与否为终点。 试验动物：小鼠或豚鼠 检 查：急性毒性物质,观察小鼠给药后48h是否死亡。 静注：Iv 静滴：iv.gtt 皮下注射：i H 口服：p.o 肌注: im 腹腔注射: i.p 皮内注射: I.D 灌胃注射: ig,4. 过敏反应检查,检查药物中的 ：异性蛋白。,实验动物：豚鼠,过敏反
22、应:(超敏/变态反应) 型(速发型):青霉素过敏性休克、过敏性哮喘 花粉,真菌,尘螨,动物皮毛 型（细胞毒型）：血细胞减少症，新生儿溶血, ABO 血型不合 （免疫复合物型）：血清病、类风湿性关节炎, 系统性红斑狼疮（SLE） 型（迟发型）： 接触性皮炎、移植排斥, 传染性变态反应,5. 升压物质：大 鼠 血压上升 降压物质：麻醉猫 血压下降 检查：导致血压降低的杂质、组胺、 类组胺 血 压：单位面积血液对管壁的侧压力， 通常指的是动脉血压. （arterial blood pressure ),1 mmHg=0.133 kpa SBP (收缩压): 100-120mmHg DBP(舒张压):
23、 60-80mmHg 脉 压: 30-40mmHg 心率(Heart rate) : 60-100次/min 心率平均次数 : 75次/min,6. 无菌检查法,检查药物中是否染有活菌。 许多生化药物不能高温灭菌，需在无菌条件下制备。,生物制品的含量测定方法： 1.理化分析法： 化学分析法：重量测定法、滴定分析法 电化学分析法： 光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法 色谱分析法：HPLC法：RP-HPLC、 HPIEC 、 HPGFC、灌注色谱法、HPCE法 2.酶法：酶活力测定法、酶分析法 3.电泳法 4.生物检定法,返 回,结果表示方法： 百分含量适用于成分已知、结 构明确的生物制品
24、 生物效价或酶活力单位 适用于蛋白质、酶类,一、理化分析法 （一） 滴定法,例 甘氨酸 Ch.P（2005） 【含量测定】 取本品约70mg，精密称定，加无水甲酸1.5ml使溶解，加冰醋酸25ml，照电位滴定法（附录 A），用高氯酸滴定液（0.1mol /L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于7.507mg的C2H5NO2。,（二） 光谱分析法 1. 紫外可见分光光度法 （1）比色法 （2）紫外分光光度法 2. 荧光分光光度法,例 细胞色素C溶液 Ch.P（2005） 【含量测定】 精密量取含铁量项下的供试品溶液1ml，置50ml量瓶中，用鉴别（
25、2）项下的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，加连二亚硫酸钠约15mg，摇匀，照紫外-可见分光光度法（附录 A），在约550nm的波长处，以间隔0.5nm找出最大吸收波长，测定吸光度，按细胞色素C吸收系数（ ）为23.0计算，即得。,例 五肽胃泌素 Ch.P（2005） 【含量测定】取本品适量，精密称定，加0.01mol/L氨溶液溶解并定量稀释制成每1ml中约含50g的溶液，照分光光度法（附录 A），在280nm的波长处测定吸收度，按C37H49N7O9S的吸收系数（ ）为70计算，即得。,（三） 高效液相色谱法,1. 反相高效液相色谱法,2. 离子对色谱法,3. 分子排阻色谱法,辅酶Q10 Ch.P（2
26、005） 固定相 十八烷基硅烷键合硅胶 流动相 甲醇-无水乙醇（1：1） 检测波长 275nm,环孢素 Ch.P（2005） 固定相 十八烷基硅烷键合硅胶 流动相 乙腈-水-四丁基甲醚-磷酸 （430：520：50：1） 检测波长 210nm,二、生化分析法,（一）电泳法 在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。 它主要是利用物质在电场中迁移速度的不同进行分离。,常见电泳的分类：,1. 自由界面电泳（U型管） 溶液中不同分子在电场作用下各 自聚集而形成明显的界面。,2. 区带电泳（惰性支持介质） 在电场作用下，使具有不同泳动 速度的组分形成
27、各自的区带。,3. 高效毛细管电泳,是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和（或）分配系数的不同而进行分离的一类新型液相分离技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。,（二）酶法：,原理： 利用酶能专一而高效地催化某些化学反应，通过对酶反应速度的测定、反应物或生成物浓度的测定来检测相应物质的含量。,生化药物定量的主要方法,1. 酶活力测定法,是以酶为分析对象的分析，目的在于测定某种酶的活力或活性，用酶活力单位和比活性表示。,酶活力是指 酶催化一定化学反应的能力。,酶活力测定是测定一个被酶催化的化学反应的速度，可以用单位时间内底物的减少或产物的增加表示，酶反应速
28、度越快表示酶活力越高,胃蛋白酶的活力测定 Ch.P（2005）,规定每1g中含蛋白酶活力不得少于3800单位。 一蛋白酶活力单位：每分钟能催化 水解血红蛋白生成1mol酪氨酸的酶量。,（水解）,三、生物检定法,利用药物对生物体（整体、离体或微生物）的作用以测定其效价或生物活性，一般采用标准品或对照品对照法。,2. 酶分析法,以酶为分析工具或分析试剂的分析方法，用酶作试剂测定样品中酶以外的其它物质的含量。分析对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至酶抑制剂。,应用范围：,无适当理化方法或理化测定结果不 能反映临床效果，如肝素。,肝素生物测定法：,血浆,延长凝结的时间,练习与思考,1.名解： 生化药物、 基因工程药物、 培养基 2生化药物的特点？ 3. 课本 P262,判断题： 1.无菌检查可用于判断供试品是否被微生物污染。（ ） 2.微生物检查中细菌数越多，则药品安全性越好。 （ ） 3.细菌内毒素检查常用的是家兔法（ ） 4.抗生素效价测定包括管碟法和浊度法 （ ）,