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1、主要内容,酶的固定化 细胞的固定化 原生质体的固定化 固定化酶与固定化细胞的性质与表征,酶的固定化,作为一种生物催化剂，酶具有专一 性强、催化效率高、反应条件温和等优点，在食品工业中发挥着重要的作用。 然而，酶的稳定性差，在强酸、强碱、热及有机溶剂等作用下容易变性，从而使酶活性降低，甚至失活； 其次，酶作用于底物后难以回收利用，在工业上难以实现连续化、自动化，并且造成反应产物分离困难。,固定化酶,固定化酶是指通过各种方法将酶固定在载体上，制备得到在一定的空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续进行反应，并且反应后的酶可回收后重复利用。,固定化酶的制备一般遵循以下几个基本原则 维持酶的催化活性和专一
2、性； 固定化的载体必须有一定的机械强度，保证其在制备过程中不受破坏； 固定化酶应有最小的空间位阻； 所选载体应具有最大的稳定性，在应用过程中不与废物、产物或反应液发生化学反应。,酶固定化的方法,依据酶的性质及用途不同，可分为吸附法、结合法、交联法、包埋法4种 吸附法 最简单、最经济的方法，可分为物理吸附法和离子交换吸附法，常用的载体有无机载体（如活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔玻璃、磷酸钙、金属氧化物等）、有机载体以及淀粉、白蛋白等天热高分子载体。吸附过程可达到纯化和固定化的目的，而且酶失活后可重新活化再生。,结合法 根据酶与载体结合的化学键不同，可分为离子结合法和共价结合法。 离子结合法是通过离
3、子键结合于具有离子交换基因的水不溶性载体的固定化方法。常用的阴离子交换剂载体：DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶，Amerlite IRA-193、IRS-410、IRA-900;阳离子交换剂载体有CM-纤维素， Amerlite CG-50、IRC-50、IR-120，Dower-50等。,共价结合法是利用酶蛋白中含有的反应基团与载体上的反应基团形成共价键而使酶固定化的方法。 偶联的基团主要是芳香氨基、羟基、羧基、羧甲基、氨基等非必需功能基团，常用的载体有纤维素、甲壳素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物等。,交联法 利用双功能或多功能试剂使酶分子之间或酶蛋白与其他惰
4、性蛋白之间发生交联、凝聚成网状结构对酶进行固定的方法称为交联法。 常用的双功能或多功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯、异氰酸酯、双重氮联苯胺等。,包埋法 包埋法是将酶包埋在多聚物内的一种方法。分为： 凝胶包埋法：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中，常用的载体有明胶、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠等； 微胶囊法：将酶包埋在直径只有几微米至几百微米的高分子半透膜中，方法有界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法以及脂质体包埋法。,凝胶包埋法的特点,微囊型包埋法,微囊型包埋法又称半透膜包埋法。 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm
5、。 半透膜孔径酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。,与凝胶型包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。,包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比： 优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。 缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。,各种固定化方法的优缺点比较,耦合固定法,单一的吸附固定化酶存在酶和载体容易脱落、结合不牢
6、固等问题。为解决上述问题，研究者不断提出新的载体和固定化方法并在耦合固定化方面进行了大量的研究，所谓耦合固定化是指几种固定化方法或载体的联合使用，即添加稳定因子和促进因子的固定化方法。耦合固定化技术能够平衡和改善传统单一固定化方法的优缺点，使酶在保持原有活性的基础上， 稳定性有所提高， 还具有操作简单，成本低廉等优点。,吸附-包埋,包埋法具有操作方便、条件温和、基本不会改变酶的结构、酶不易脱落等优势、但也存在机械强度差、酶易泄漏、传质阻力较大等问题。利用耦合固定化技术能够很好地解决上述问题。 包埋法使用的一些凝胶分子的间隙较大，容易造成酶在其中的疏漏，通常可以应用以下方法解决:用交联或共价结合
7、的方法处理包埋酶颗粒；将酶吸附在一些大分子颗粒上来增大酶分子的体积。将葡萄糖淀粉酶吸附在凝胶化的玉米淀粉颗粒上，再利用海藻糖包埋，解决了单一吸附造成的酶泄漏问题，同时包埋-吸附法改善了包埋法传质阻力大的缺点，吸附剂的加入降低了固定化细胞的疏漏，增加细胞在载体中的分散性 。研究表明将吸附剂添加到卡拉胶包埋体系中，与单一的吸附相比固定化细胞转化 L-苯丙氨酸转化能力提高了52%，解决了转化能力差的问题,吸附-交联,酶与吸附载体通过的物理吸附或离子吸附作用结合，结合力较弱，在高离子强度和高pH 值情况下容易解析，从而造成酶的泄漏。交联作用能够增强酶和载体之间的作用力，避免单一吸附固定化酶易脱落造成产
8、物污染的问题，提高固定化酶的稳定性。 利用纯化的海沙固定环胡精葡萄糖苷转移酶( CGTase)，虽然吸附率能够达到 98%，但酶很容易从介质上脱落，通过戊二醛交联之后增强了结合力，解决了酶容易脱落的问题，交联之后酶在反应8 批次后，仍然能够维持80%的活性。 研究发现用蛋壳吸附后用戊二醛交联固定化脂肪酶的方法机械强度好，能够抵挡较强的剪切力，比单一利用海藻酸包埋法更适合于催化搅拌罐中的油脂反应， 能重复使用8 批次。 吸附-交联法还具有操作简单、吸附容量大、材料来源广泛、成本低廉等优点。,细胞的固定化,采用物理或化学的方法固定细胞，是利用酶或酶系的一条捷径。 优点： 免去破碎细胞提取酶的复杂过
9、程。 酶在细胞内环境中，稳定性更高，固定后酶活损失较少。 可催化较复杂的反应（复合酶系统）。 制备成本低。,缺点： 多适用于胞内酶； 对底物和产物有一定限制：要求底物、产物易透过细胞膜。 产物较复杂，有副反应，给提取增加了难度。,固定化细胞的分类,细胞固定方法,直接固定法 不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。 吸附法 细胞表面带有电荷，因此可以通过离子交换或吸附作用结合于载体。该法简便，易于再生，但结合力弱，易脱落。工业应用上较少。,包埋法 同酶包埋法 例：海藻酸钙-聚赖氨酸（ALG-PLL）包埋技术 动物
10、细胞先用海藻酸钙凝胶包埋聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜柠檬酸钠溶液处理，使海藻酸钙凝胶溶解聚赖氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化动物细胞,原生质体的固定化,(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。,原生质体的固定方法,一般采用凝胶包埋法。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。 注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。 原生质体的制备 要求：保持膜的完整性，不能使细胞内部的结构遭到破坏 制备：对数期细胞的收集高渗溶液中加酶破壁分离
11、除去细胞碎片、完整的细胞及酶（密度梯度离心）原生质体 原生质体的固定 原生质体等渗缓冲液中配成一定浓度的原生质体悬浮液凝胶包埋,固定化酶与固定化细胞的性质与表征,酶经固定化后，催化作用由均相反应转变为非均相反应，同时酶的结构在一定程度上发生改变，酶、底物、载体之间的静电相互作用带来的扩散效应、空间位阻、电荷效应、载体性质造成的分配效应等必然会对酶的性质产生影响。 评价固定化酶的参数主要有以下几点：,活性与稳定性变化,活力大多数情况下比天然酶小，其专一性也可能会发生变化。 热稳定性，PH稳定性，贮存稳定性，对各种有机试剂、酶抑制剂及蛋白质的稳定性提高。,原因主要有： 固定化酶与载体多点连接，可防
12、止酶分子的伸展变形； 酶活力释放缓慢； 酶经固定化后，酶分子间相互作用机会丧失，抑制了酶的自降解。,最适温度和最适pH值,最适温度 大多数固定化酶热稳定性提高，最适反应温度也随之提高 最适pH值 带负电荷的载体，催化反应的产物为酸性：向碱性偏移； 带正电荷的载体，催化反应的产物为碱性：向酸性偏移； 不带电荷的载体，催化反应的产物为中性：不发生偏移。,反应动力学,固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。 固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表观Km值显著增加。 原因： 酶蛋白分子的高级结构发生变化 载体的静电相互作用,固定化细胞的性质
13、,与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。,固定化酶的评价指标,酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法 半衰期 在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。,偶联率及相对活力 偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100% 活力回收=固定化酶总活力/加入酶的总活力100% 相对活力=固定化酶总活力/ (加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)100%,谢谢观看！,