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1、一、实验目的及要求 1. 学习微生物涂片、染色的基本技术， 掌握 细菌的简单染色法。 2. 学习并掌握革兰氏染色法，了解革兰氏染 色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要 性。 3. 巩固油镜的使用和无菌操作技术。 二、实验原理 简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的染 色方法。常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和 中性染料三大类。 碱性染料电离时，其分子染色部分带正电荷，能和带负电 荷的物质结合。由于细菌生长于中性环境中一般带负电荷 ，所以通常采用碱性染料使其着色。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷 增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色 。中性染
2、料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝 、伊红天青等。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作 为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（ G）两大类。 G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽 聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类 脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复 合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成 红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱 色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因 此细菌仍保留初染时的颜色。 三、
3、实验器材 1.菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）， 大肠杆菌（Escherichia coli）， 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 2. 染色剂：草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复红染 液，革兰氏染色液。 3. 其他：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶 （内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，废液缸等。 四、实验步骤 1、简单染色： （1）涂片：注意取菌不要太多； （2）干燥：室温自然干燥； （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上， 通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）； （4）染色：涂片加草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复 红染液 1min； （5）水洗
4、：自来水冲洗，直至流下的无色； （6）干燥：自然晾干或用电吹风吹干； （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的 视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油，油镜观察细菌的形态。 2、革兰氏染色 （1）制片：制片方法与简单染色相同； （2）初染：加适量（以刚好覆盖菌膜为 宜）的结晶紫染色液染色1-2min，水洗； （3）媒染：碘液媒染1min，水洗； （4）脱色：连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无色， 立即水洗； （5）复染：滴加番红复染约2min，水洗； （6）镜检：干燥后，油镜镜检观察。 （7）混合涂片法：按上述方法，在同一载玻片上，以大肠 杆菌和枯草芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄
5、色葡 萄球菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。 GG + + 干燥、固定干燥、固定 结晶紫染色结晶紫染色 GG - - 碘液媒染碘液媒染 乙醇脱色乙醇脱色 蕃红复染蕃红复染 Figure Mixed culture of large Gram positive rod and small Gram negative rods. 五、注意事项 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度 ，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间 过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时 间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难 以严格规定。 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去 玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 3.选用幼龄的细菌。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶 常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 六、实验报告 1、结果 给出枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡 萄球菌形态图，并注明其革兰氏染色反应。 2、思考题 （1）简单染色法中各步骤的注意事项是什么？