六味地黄丸与桂附八味丸临床应用之不同-课件-精选文档.ppt

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1、中醫腎之定義：解剖與功能 n素問脈要精微：腰者，腎之府。 n難經四十二難：腎有兩枚，重一斤一兩（134-148克） 。 n素問宣明五氣：腎主骨。腎藏志。 n素問陰陽應象大論：腎生骨髓。 n素問金匱真言論：北方黑色，入通於腎，開竅於二陰 。 n素問靈蘭祕典論：腎者作強之官，伎巧出焉。 n素問六節藏象論：腎者，其華在髮。 n靈樞五閱五使篇：耳者，腎之官也。 n靈樞本神篇：腎藏精，精舍志。 中醫腎之生理功能 n中醫對“腎”生理功能主生殖生長過程描述，最 早見於內經素問上古天真論：女子七歲腎氣盛 ，齒更髮長。二七而天癸至，任脈通，太衝脈 盛，月事以時下故有子。三七腎氣平均，故真 牙生而長極。丈夫八歲腎

2、氣實，髮長齒更。二 八腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和故能有 子。三八腎氣平均，筋骨勁強，故真牙生而長 極。五八腎氣衰，髮墮齒槁。七八、腎臟 衰，形體皆極。 中醫腎之生理功能一藏精 n1. 廣義：人體一切精微物質氣血津液。 n2.狹義：腎所藏之精，推動人體生長、發育、 生殖。 n3.腎精的來源與關係： n先天之精來自父母，後天之精來自水谷之精， 腎受五藏六腑之精而藏之。 n腎精腎氣的作用：精能化氣，氣能生精。主持 人體生長發育主生殖，化生血液，精能生血， 血化精，調節機體的代謝及其生理功能。 中醫腎之生理功能二主水三主納 氣 n主水飲入於胃，游溢精氣，上輸於脾 ，分清泌濁，上歸於肺 ，通調水道

3、，下 輸膀胱。主持調節水液代謝的作用。 n主納氣腎對肺吸入的清氣，有攝納吸 引作用，精氣不足，攝納無權，氣浮于 上，腎不納氣，表現呼吸表淺、呼多吸 少、張口抬肩、動則尤甚。臨床常見氣 喘，慢性阻塞性肺部疾病。 腎陰與腎陽（命門） n難經開始分左為腎，右為命門；“命門者，精 神之所舍也，原氣之所系也，男子以藏精，女 子以系胞，其氣與腎通”。 n脈經引脈法贊：腎與命門，俱出尺脈。 n宋 陳無擇：“左腎為腎藏，其府膀胱；右腎為 命門，其府三焦”。 n到明朝 虞搏認為兩腎固為真元之根本，雖為 水藏而實為相火寓乎其中，兩腎可總稱命門。 n張景岳認為：命門居兩腎之中，即人身之太極 ，由太極以生兩儀，而水火

4、具焉。 腎之經絡 n靈樞經脈篇：腎足少陰之脈，起於小指 之下，斜走足心，出于然谷之下，循內 踝之後，別入跟中。以上行踹內，出膕 內廉，上股內後廉，貫脊，屬腎，絡膀 胱。其直者：從腎上貫肝膈，入肺中， 循喉嚨挾舌本。其支者：從肺出絡心， 注胸中。 腎陰虛-病理變化 n類經附翼真陰論：真陰腎水不足， 不能滋溉營衛，漸自衰羸，或虛熱往來 ，自汗盜汗，或神不守舍，血不歸原， 或勞損傷陰，或遺淋不禁，或氣虛昏， 或眼花耳聾，或口燥舌乾，或腰酸腿軟 。凡精髓內竭，浸液枯涸等證，俱宜速 壯水之主，以培左腎之元陰。 腎陰虛（左腎內分泌腺軸）- 臨床證狀 n腰膝酸軟，足跟作痛、頭目眩暈、 耳鳴如蟬、五心煩熱、舌

5、燥咽乾、 舌紅脈細。 n素問刺熱論:腎熱病者，先腰痛胻酸，苦 渴數飲身熱，熱爭則項痛而強，髓寒且 痠，足下熱，腎熱病者，頤先赤。 腎陽- 命門病理變化 n素問至真要大論:諸寒收引，皆屬於腎。 n類經附翼真陰論：元陽不足，或先天稟衰 ，或勞傷過度，以致命門火衰，不能生土，而 為脾胃虛寒，飲食少進，或嘔惡膨脹，或反胃 隔塞，或怯寒畏冷，或臍腹多痛，或大便不實 ，瀉利頻作，或小水自遺，虛淋寒疝，或以寒 侵溪谷，而為肢節痺痛，或寒在下焦，而為水 邪浮腫。總之，真陽不足者，心神疲氣怯，或 心跳不寧，或四肢不收，或眼見邪魔，或陽衰 無子等症，俱宜益火之源，以培右腎之元陽。 腎陽- 命門臨床證狀 n畏寒肢冷

6、、腰虛冷痛、面色恍白、夜尿 頻多、小便清長或尿少，男子陽萎滑精 女子帶下精冷，舌淡邊有齒痕，脈沈弱 而遲。 n中醫腎虛病理變化有腎陽虛衰，腎氣不 固，腎不納氣，腎虛水泛，命門火衰。 中醫醫院在德國廖家楨北京中醫藥大學東直門醫院 n1991/03/18德國第一家魁次汀市中醫醫院，中 藥、針灸、按摩和氣功綜合治療。 n保持特色，發揮優勢，競爭核心是療效。 n病人不管中醫、還是西醫特色，誰能治好病、 解除痛苦就找誰。 n中西醫同時存在的歷史條件下，中西醫結合是 歷史的必然，這是科學發展的必然規律，是不 以人們的意志而受轉移。 n中藥飲片品種真偽、加工的質量，及重金屬、 農藥的含量。 科研工作是中醫發

7、展的基礎 n臨床取得療效後，科研工作必須及時跟 上。不僅推動了中醫藥學術發展，同時 也豐富了現代醫學的內容。 n中西醫結合的研究工作，要在理論上有 重大突破，提出 具有中西醫結合特色的 新理論。 n只有理論上有重大突破，才能進一步推 動臨床實踐的發展和提高。 中醫藥從傳統走向現代周金黃軍事醫學科學院 n傳統中醫藥走向現代，是歷史發展的必 然。 n中藥發展龍頭在植化，其前身在藥理， 其運動在臨床，其動力在制劑。 n傳統助陽藥巴戟天生藥提取中樞抗抑鬱 作用寡糖成分，作用于5-HT與多巴胺系 統，兼有促進免疫功能，提高T細胞活 力。 中醫藥從傳統走向現代 n中藥植物化學家與藥理學家，聯合提出 一經典

8、複方新劑型，明確其成分的規格 含量藥效，供臨床檢驗與試用。 n中藥藥理之研究不能脫離中醫系統理論 之指導。前人立方必以中醫理論為依據 ，實踐又證明其理論可行。 摘要(1) n慢性腎炎、腎衰病人、腎陽虛腎陰虛是中醫臨床診斷常見 的辨證證型分類，已有許多研究顯示其生化指標有顯著不 一樣，如腎陽虛cAMP下降,cGMP上升,甲狀腺素、FreeT3及 細胞色素氧化脢活性下降，而腎陰虛則cAMP上升,cGMP下 降，甲狀腺素、FreeT3及細胞色素氧化脢活性上升，而證 型是對複雜的病因、病機、病態、病勢作概括性歸納分類 ，其根本即源於細胞基因表達型式的改變。 n現在由於分子生物技術的進步，我們知道這些生

9、化物質的 改變，均與細胞基因的表達剖面息息相關，利用DNA微陣 列技術，應用於不同條件如健康、腎陽虛或腎陰虛以及用 藥之有無，可在單一的雜交步驟，同時測得數千不同 mRNA的量，作組織細胞基因表達不同之分析，探討表現 突出基因是否與生化改變相關，基因晶片研究生命現象， 是重大突破且為強而有力的工具。 摘要(2) n本研究的目的:將探討中藥培養腎細胞株抽取mRNA ，利用基因 晶片分析基因表達調控的影響。 方法:使用腎陽虛和腎陰虛著名 方劑桂附八味丸和六味地黃丸培養胚胎腎細胞株，抽取細胞 mRNA用白果能博士基因晶片，看其基因表達調控的影響。 n結果:桂附八味丸即在六味地黃丸加上肉桂、附子後，其

10、基因表 達明顯上調和下降各有20個基因，其中3個基因1.Cytochrome oxidase V1b向上調控粒腺體內膜上細胞色素氧化脢活性增加，增 加粒腺體ATP合成。2.Mevalonate diphosphodecarboxylase：MDD 於細胞質Peroxisomes內，促進合成酯醇和膽固醇。3.Adenine phosphoribosyltransferase：APRT此酵素缺乏的遺傳疾病，大都將 導致慢性腎炎腎衰，有顯著意義。 摘要(3) n結論：桂附八味丸透過細胞向上調控 COX V1b、MDD 和 APRT 3個基因，增加線粒體內膜上細胞色素氧化脢活性促進ATP合成 、促進合

11、成酯醇和膽固醇以增加皮質激素和性荷爾蒙產量與防止 腎病變，達到臨床腎陽虛證型治療作用。 n脈分左腎右命門、證分腎陽虛和腎陰虛，生命之門-腎陽、命 門火表現在線粒體對細胞能源的供應，身體賴以生存；腎陰涵 蓋內分泌腺軸腎上腺、性腺、腎藏，居主導身體生長發育功能。 n這些有意義基因需再作RT-PCR，確認其基因功能及mRNA表達 量，是下一步必須研究的課題。將設計腎陽虛造模動物，餵食桂 附八味丸後，取丘腦、腎上腺、肝腎細胞，血中白血球，分析是 否有類似特殊基因表達型態，及顯著調控生化變化，期望能對腎 陽虛病人基本生物分子活動深一層瞭解，找到診斷腎陽虛基因表 達型及有效的治療基因。 中西結合研究方法:

12、 王傳,陳可冀.中國中西結合雜誌Feb.2000 n1.臨床流行病學(Clinical Epidemiology) ： 用醫學統計學原理方法，運籌學、 社會學、心理學與 臨床醫學相結合的一門邊緣學科 ， 近來用在病證研 究和新藥臨床試驗。 n2.實證醫學(Evidence-based Medicine) ： 以證據為基礎的醫學，治療手段和方法 ，更具有效 性和安全性。 n3.生物科技技術(Biotechnology) ： 分子生物技術、基因晶片技術，包括數理統計 方法和電腦運算方法。 實證醫學 Evidence-based Medicine n定義： n正確地利用現有最佳醫學證據來為全民 或特

13、定族群的病人訂立治療計劃及提供 醫療服務的醫學。 n有多少證據（文獻）作多少醫療（ Evidence-based care）。 醫療行為的決策Decision-Making n永遠的真理 Everlasting truth. n教科學理論 Proved theory. n專業訓練 Practice training. n臨床經驗 Personal experience. n文獻探索 Critical appraisal. 實證醫學五項實踐步驟 n特殊化回答問題 n尋找相關證據. . n審慎評估證據 -. n整合臨床專家和 應用 n評價自我執行工 作 nspecify answerable qu

14、estions. nsearch for relevant evidence ncritically appraise the evidence importance and validity. nintegrate with clinical expertise and apply. nevaluate ones own performance. 後基因組時代中醫証候組研究的思考 王忠等,中國中西結合雜誌 Aug,2001 n1.研究思路: 國內外已有大量研究，表明中藥對基因表達、修飾 有確切的作用，不同的証候-基因表達組應有差異，生物體不論 組織細胞功能和外形有多不同，所含都是一整套相同的

15、基因，但 基因表達格局不同，不同的基因表達調控有其個性，也有其共性 。 n2.意義: 深化中醫証候客觀性複雜性的認識。葯物基因組學 (phamacogenomics)將應運而生，闡述基因序列變異及其對藥物 反應影響的科學。尋求病証結合的突破口-“共同的功能基因”， 中西醫兩種不同理論研究的是同一個對象，在一定的結構或功能 層次上，必然有其共性的物質基礎。 n3.WHO生物醫學家認同：“個體化的具體治療”是臨床試驗的最高 層次，建立單核甘酸多態性(SNP)為代表的DNA序列變異的系統 目錄。 基因晶片在中醫藥研究的應用 李勁平, 王培訓 JJCM.Dec,2001n1.中醫証的研究: 中醫証的出

16、現，是由於某個或某類相 關聯基因發生異常所致，利用基因晶片檢測不同証的 基因表達譜改變，給于不同的治療，實現中醫辨証施 治的現代化。 n2.中藥治病機理研究: 中藥要令人信服，需用現代生物 科技闡明扶正，表現中藥促進某個或某類基因的表達 。 n3.中藥有效成分的篩選和中藥新藥的開發: 檢測有效成分。 n4.中藥材鑑定: 每種中藥材DNA序列寡核甘酸探針作成基因晶片 ，可用於中藥材優質品種篩選和監測。 n5.面臨問題: 靶器官和靶組織的確定，實驗動物基因表達譜的研 究，“基因-功能”關係的研究。 陽虛內在實質 李東濤等中西醫結合雜誌2000 n遺傳學方面：基因(體胖居多,LA-b5,Ow3,Ag

17、頻率分布低)。 n物質代謝：轉鐵蛋白、纖維蛋白顯著低於正常人。 n內分泌：尿中17羥皮質類固醇、17酮類固醇低於正常值。血管緊 張素II，醛固酮、甲狀腺素T3，促甲狀腺激素低於正常對照組， 外周血中混合白細胞糖皮質激素受體，明顯低於正常組。 n免疫功能：免疫功能低下或紊亂。 n神經功能：副交感神經亢奮狀態，交感神經功能衰減。 n微量元素：血清銅、鐵、含量升高，zn/cu 值明顯降低，Br降， 血清鋅值低於正常對照組，其順序：正常人脾陽虛型腎陽虛 型脾腎陽虛型。 ncAMP和cGMP： cAMP降低， cGMP偏高，cAMP/cGMP比值降 低。 n微循環和血液流變學，末梢溫度低，血流速減慢，血

18、沉較快，動 脈臂口徑相對變細。 n腎功能：尿滲透壓降低，尿濃縮功能減退與腎功能損害有正相關 老年期腎陰陽虛損大鼠動物造模生化指標與粒腺 體能量代謝 肝粒腺體呼吸鏈氧化脢活性及MDA比較趙偉康等中醫基礎醫學雜誌2001 組 別隻數Cytochrome C 氧化脢（ onm/min mg.pr） NADH氧化脢 （onm/min. mg.pr） 琥柏酸氧化脢 （ onm/minmg.pr ） MDA(nmo/ mg) 腎陽虛9230.042.0235.1 56.064.9 29.50.568 0.106 腎陰虛9279.8 27.8215.8 30.155.315.40.463 0.098 老年對

19、照14258.5 45.0222.2 59.059.4 24.60.476 0.058 分子生物技術探討疾病診斷和治療 n目前臨床診斷和治療都建立在血液生化和病理檢查， 將進展到生物化學和分子生物技術，來鑑定導致疾病 的潛在基因和細胞生化變化。（新技術研究方向） n生物科技在腎臟病的診斷、特性治療、和有效預防， 將導致重大變革，利用分化展現生物技術和基因晶片 可顯示訊息核醣核酸（mRNA）的基因表達型式（ gene expression patterns）的多種變化，而且可有效鑑 定腎臟病以前不知道的基因，和證實已知基因的新角 色。 n新一代單核酸基因多形性（SNP）基因圖譜，將促進 基因的篩

20、選，可鑑定出單一或多基因參與，導至每個 人對疾病易感性的不同（體質因素） (David A A et all,seminars in nephrology 2000)。 何謂去氧核糖核酸微陣列 DNA microarray 基因晶片依其製造成法不同可分兩類： nA.寡聚核酸晶片，簡稱核酸晶片（Oligonucleotide chip ）：半導體晶片製程類似的光顯影術，利用光化 學反應製造稱之。 nB.去氧核糖核酸微陣列（DNA microarray）：使用自 動機械將聚合脢聯鎖反應(PCR)，來表現之訊息核糖 核酸（mRNA）所反轉錄之互補去核糖核酸（cDNA ），將其以高密度點製而成。(目前

21、使用較多，本實驗 用這種方法). DNA微陣列排印系統： n1.選定希望進行研究基因，數目可達一萬個不同基因 。 n2.將少量已知序列且可以唯一代表個別基因的DNA片 段約五、六百個鹽基，利用聚合脢連鎖反應法將該片 段數量放大。 n3.接著利用自動機械手臂系統，點印於經過特殊表面 處理過的載玻片或薄膜(本實驗用)上，用以點印的尖端 類似鋼筆圓形針頭，中間有約0.0025mm 狹縫，用以 虹吸DNA片段溶液，每一點直徑約為0.15mm因此在 22 平方公分，可點印約一萬點基因。 n4.每一點代表唯一的一個基因，而每一點約有數千萬 個相同的DNA片段，這樣的點或DNA片段在基因晶片 研究中稱之為探

22、針(probe)。 共軛焦雷射或呈色掃瞄系統用以讀取 DNA微陣列實驗後的結果： 操作 : n1)用螢光或呈色物質(本實驗用這種方法). 對研究生物樣本欲知基因加以染色標誌，稱之為標 的物(target)。 n2)標的物和DNA微陣列，進行配對接合反應，稱之為 雜交(hybridization)。 n 3)將沒有配對接合物的生物樣本清除掉。 n 4)由標的物和那些探針 (指在DNA微陣列上，已知位置和已 知序列的DNA片段) 配對結合，即可得到生物樣本的基因 訊息。 DNA微陣列應用： n兩種生物樣本研究實驗，有對照組如健康組和病變組 ，或有使用藥和無使用藥物組，因有兩部不同波長的 雷射或(本

23、實驗用)兩種不同的呈色物質，故可激發兩 部不同和偵測兩種不同特定波長的螢光物質，或(本實 驗用)抗體結合呈兩種不同顏色，可同時進行不同基因 表現模式的分析，對研究具有重大意義。 n我們可以很方便、可靠的進行比較實驗，目前大多數 學者認基因晶片技術，對基礎生醫研究及臨床診斷治 療應用，將會有重大影響。 n基因晶片各式各樣使用，其限制僅在於想像力. 六味地黃丸 1.源自宋錢乙“小兒藥證直訣”：六味地黃湯是滋補腎 陰的基礎方劑，對慢性腎炎和慢性腎功能衰竭“腎陰 虧虛”者選用本方。 n2.製方之義： 汪昂醫方集解三補三瀉 : 熟地膩補腎水，有澤瀉宣泄腎濁。山庾 肉溫澀肝經，有丹皮清泄肝火。山藥收攝脾經

24、，有茯苓淡滲脾 濕。 錢氏考慮小兒稚陽之體，無需助陽，於是減去金匱要 略八味腎氣丸中剛燥的附子,肉桂專補腎陰。 3.腎陰不足臨床表現：腰膝酸軟，足跟作痛、頭目眩 暈、耳鳴如蟬、五心煩熱、舌燥咽乾、舌紅脈細。 4.臨床應用：慢性腎炎高血壓型腎陰虛用之較多，因 為陰虛易生內熱，常以生地（乾地黃）易熟地，生 地性寒，在滋陰補腎，同時兼具清熱之功，且滋膩 礙胃之弊亦輕。 桂附八味丸 n1. 源自東漢張仲景: 金匱要略“腎氣丸”，是溫補腎陽代 表方劑，對慢性腎炎和慢性腎衰，證屬“腎陽虛”的首 選方。 n2.腎氣丸製方之義 : 體現（內經素問） “善補陽者，必於陰中 求陽，則陽得陰助而生化無窮”的精神，本

25、方雖係溫補命火 之劑，但以六味地黃丸滋養腎陰為基礎，僅用少量桂 附以助腎陽。 3.腎陽不足的臨床表現：畏寒肢冷、腰虛冷痛、面色 恍白、夜尿頻多、小便清長或尿少，男子陽萎滑精女 子帶下精冷，舌淡邊有齒痕，脈沈弱而遲。 n 4.臨床應用：常以肉桂易桂枝，因為肉桂辛甘大熱之 品，氣厚純陽，守而不走，專補命門之火，用量一般3 -10克、附子一般用10克。 慢性腎衰常用方腎氣丸 n東漢張仲景金匱要略:虛勞腰痛，少腹拘急 ，小便不利者，八味腎氣丸主之 腎氣丸取納氣歸腎之意，以溫補腎陽為主，輔 以滋陰利水。常配車前子、川牛膝以利水消腫 如濟生腎氣丸。 n地黃八兩 山藥四兩 山茱萸四兩 澤瀉三兩 茯苓三兩 牡

26、丹皮三兩 桂枝 附子炮 各一兩，上八味末之， 煉蜜和丸，梧子大酒下15丸，加至25丸日再服 。 地黃 玄參科地黃根莖Rehmannia glutinosa n性味：生地甘寒熟甘溫，入心、肝、腎經。 n功能：滋腎水、補真陰、填骨髓、生精血、聰耳明目 、黑髮烏髭。 n主治：勞傷風痹、胎產百病、為補血之上劑。能治陰 虛發熱、消渴。 （生地清熱涼血、養陰生津。） n成分：含貝它谷酯醇與甘露醇及少量豆酯醇，微量菜 油酯醇、地黃素、生物鹼、脂肪酸、葡萄糖、精胺酸 。鮮品曬乾為生地，經久蒸九曬成熟地後，部份地黃 多糖和低聚糖可水解成單糖，但降血糖主成分三糖苷 幾乎不分解。 n藥理：抑皮質醇代謝、增血量、抗放

27、射、保肝、降血 糖、止血、利尿、消炎。地黃低聚糖促進Stem cell造 血，NK、CTL活力，T Cell - IL-2分泌 。 山藥署蕷科山藥塊莖Dioacoria panthaica n性味：甘平。入脾、肺、腎經。 n功能：補脾、養肺、固腎、益精。 n主治：脾虛泄瀉、食少浮腫、肺虛咳喘、腎虛 尿頻、遺精帶下、消渴。 n成分：含山藥多糖。 n藥理：免疫促進作用 。 山茱萸山茱萸科山茱萸果實Cornus officinalis n性味：甘酸澀而微溫。入肝、腎經。 n功能：補肝腎、澀精氣、固虛脫。 n主治：腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽痿遺精、小便 頻數、肝虛寒熱、虛汗不止、心搖脈散。 n成分：含山茱

28、萸代、鞣質、沒食子酸、熊果酸 、維生素A。 n藥理：免疫促進作用，抑制T cell - IL-2量表達 ，抗炎抗過敏 。 肉桂，屬樟科 n1.別名：牡桂、紫桂、大桂、辣桂、桂皮、玉桂。 n2.性味：味辛甘，性大熱、有小毒。歸經：入腎、脾 、膀胱經。 n3.功能：補元陽、暖脾胃、除積冷，通血脈。 n4.主治：溫補腎陽、溫中逐寒，宣導血脈。其性渾厚 凝降、守而不走、偏暖下焦、能助腎中陽氣（命門之 火）並能納氣歸腎，引火歸元。 肢冷脈微、亡陽虛脫 、腹痛泄瀉、寒疝奔豚、腰膝冷痛、經閉癥瘕、陰疽 流注及虛陽浮越、上熱下寒等 n5.成分：含揮發油,桂皮油1 2 ，主成分為桂皮 醛、桂皮酸，並含少量乙酸桂

29、皮酯、乙酸苯丙酯。肉 桂作用和緩渾厚，能補下焦腎中不足的真火（溫補腎 陽），更能引火歸元以息無根之火，故稱之能“救陽 中之陽”。補益藥多用肉桂。 附子 毛艮科 n1.別名：淡附片、黑附片、制附片 n2.性味：甘、辛、大熱；有毒。歸經 : 心、脾 、腎經。 n3.功能：溫陽、散寒、止痛，為溫補命門之主 帥、回陽救逆之要藥。 n4.主治：亡陽欲脫、命門火衰、胸腹寒痛、痺 證，陽痿、水腫、尿少、寒結便秘等病證。 n5.成分：含多種生物鹼，次烏頭鹼、烏頭鹼、 新烏頭鹼等。附子大毒，宜先煎。 基因晶片萃取兩種待比較細胞mRNA偵測 基因表達操作步驟. 1.腎細胞培養(六味地黃丸和桂附八味丸) 2.分開萃

30、取兩種待比較細胞RNA(六味地黃丸和桂 附八味丸培養的腎細胞) 3.從RNA分離出mRNA 4.兩種呈色物對mRNA反轉cDNA基因標誌 5.兩種呈色標誌未知DNA基因與晶片上已知探子 基因進行雜交和呈色反應 6.掃瞄電腦記錄及影像資料定量分析 材料與方法： n一. 中藥複方：來源購自順天堂濃縮科學中藥，六味 地黃丸和桂附八味丸 n二. 不同測試藥物濃度的製備： . 將部份濃縮中藥加去離子水，使其濃度達10mg/ml 後，於37持續混合60分鐘 . 將混合中藥溶液經3000rpm速度離心15分鐘 . 離心後取溶液上清潔部份，先後以0.45微米和0.2 微米濾紙濾 . 過濾完中藥濾液，以DMEM

31、培養液，依序稀釋成 1mg/ml，0.5mg/ml， 0.2mg/ml 等不同濃度的試液備用 ， . 以六味地黃丸培養溶液當作桂附八味丸對照組 材料與方法 n三. 細胞及培養條件 . 採人類胚胎腎293細胞(American Type Culture Collection) 。 . 培養液DMEM (Dulbeccos modified Eagles medium, GIBOCOBRL，Grand Island NY) ，含10 牛血清FBS (fetal bovine serum,Hyclone，Utah) ，及100U/ml penicillin-streptomycin (GIBCOBR

32、L)作為培養基，置於 含95%空氣 5%二氧化碳，維持在37穩定溫度 incubator中成長。 材料與方法 n四. RNA抽取和DNA微陣列使用 1.人類胚胎腎293細胞，用DMEM培養到5107 個細胞 ，然後分別加入0.2mg/ml, 0.5mg/ml和1mg/ml 六味地 黃丸和桂附八味丸試劑培養48小時，然後把細胞收集 依照Rneasy Mini Protocol for the isolation of total RNA from renal cell 抽取Total RNA ，再純化mRNA做cDNA 探針標記。 2.使用白果能博士的microarrays ，和已標記萃取物作雜

33、 交反應，來測腎細胞基因表現，呈 (藍和紅)色的結果 。 3.Array Scanning 和image quantitation，在白果能實驗室 完成Data analysis by computer programs。 材料與方法 n五.Microarray 基本步作: . cDNA為應用Biotin -16-dUTP(藍色) ，或 Digoxigenin-11- dUTP(紅色)標示，其它標示上dNTP和 MMLV反轉錄脢所合成。 . 探針藉Southern hybridization procedure 於微陣列膜 上雜交。 . 微陣列含PCR amplified 9600 nonre

34、dundent cDNAs 。 . 雜交後，使用streptavidin -galactosidase 和 antidigoxigenin -Alkaline phosphatase來測雙重顏色， 藉先後處理上Fast red TR/naphthol AS-Mx substrate 和 X-gal之後，將先後產生紅藍呈色反應。 . 使用drum scanner 偵測Image。 六味地黃丸 2 293 cells 293 cells 93 cells 六味地黃丸 桂附八味丸 結果： 表一：Genes that increase under Rehmannia Eight Formula tre

35、atment (compare to the Rehmannia six Formula )detected by DNA microarray. ESTs：expressed sequence tags, the function of these genes are unknown Gene Fold increase Cytochrome c oxidase subunit Vb 2.164913 Pre-B-cell leukemia transcription factor 2 1.960811 Neuroblastoma stage 4S gene 1.89937 ESTs 1.8

36、6632 Nitrilase 1 1.761921 v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 1.749822 Homo sapiens mRNA for KIAA0906 protein,partial cds 1.744295 結果2： Gene Fold increse Homo sapiens clone 24664 PH-20 homology mRNA,complete cds 1.743664 Adenine PhosphoRibosylTransferase 1.720141 Mevalonate(Diphospho)Decar

37、boxylase 1.676007 Microtubule-associated protein tau 1.674997 Sp2 transcription factor 1.646849 Homo sapiens mRNA for APS, complete cds 1.607411 Caspase 10,apoptosis-related cysteine protease 1.604297 Homo sapiens clone 24810 mRNA sequence 1.60061 ESTs 1.588153 H2A histone family, member L 1.55779 P

38、roteins kinase,mitogen-activated,kinase 3 (MAP kinase kina) 1.548823 ESTs 1.542606 H.sapiens MacMarcks mRNA 1.540559 結果3： 表二：Genes that decrease under Rehmannia Eight Formula treatment (compare to the Rehmannia six Formula )detected by DNA microarray. Genes Fold decrease Human mRNA for KIAA179 gene,

39、 partial cds -3.11564 Carboxypeptidase B2 (plasma) -3.11501 ESTs -3.03269 B-cell CLL/lymphoma 2 -3.01898 Arachidonate 5-lipoxygenase -3.01033 homeo box 11(T-cell lymphoma 3-associated breakpoint) -3.00884 Protein kinase, mitogen-activated 6(extracellular signal-re -2.98743 cell division cycle 27 -2.

40、92538 ESTs -2.87559 結果4： Gene Fold decreased ESTs -2.87271 v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog-like 1 -2.85719 ESTs -2.84667 Faciogenital dysplasia (Aarskog-Scott syndrome) -2.84425 Homo sapiens clone 192 Rer 1 mRNA, complete cds -2.82548 Asparaginyl-tRNA synthetase -2.81807 Flavin con

41、taining monooxygenase 3 -2.80841 Inhibitor of DNA binding 1,dominant negative helix-loop-hel -2.79523 Human Chromosome 16 BAC clone CIT987SK- A-735G6 -2.79385 zinc finger protein 42(myeloid-specific retinoic acid-resp -2.79229 serum amyloid A1 -2.79083 結果1 n實驗中桂附八味丸培養腎細胞，濃度0.2mg/ml 時生長情況最佳，而濃度2mg/ml

42、培養48小時 ，細胞漂浮在培養基表面，顯示無法順利生長 。 n桂附八味丸和六味地黃丸培養HEK 293腎細胞 株，其基因表達上調最明顯的20個基因，數值 介於2.16到1.54 (表一)和下降最顯著20個基因 ，數值介於3.12到2.79(表二)。 n本表的數值取log2實驗組/對照組，因此假如數 值為1，則其基因表達為21 =2倍，數值為2則 其基因表達為22=4倍，數值為3則其基因表達 為23=8倍。 結果2 n基因表達上調最大的是Cytochrome c oxidase subunit V1b，其它 酵素基因依序有Nitrilase 1、Adenine phosphoribosyltra

43、nsferase、 Mevalonate diphospho- decarboxylase、Caspase10, apoptosis-related cysteine protease、Proteins kinase,mitogen-activated, kinase 3，共6 個酵素基因。 n下調基因表達抑制最大的是Human mRNA for KIAA 179 gene, partial cds，其它酵素基因依序有Carboxy- peptidase B2 (plasma)、 Arachidonate 5-lipoxygenase、Asparaginyl-tRNA synthetase、

44、Flavin containing mono- oxygenase 3，共4個酵素基因。 n上下調控基因雖然大都在4-8倍左右，不若其他文獻報 導210高達千倍，但酵素微量變化即可明顯促進化學反 應，可能因此桂附八味丸無論在細胞培養，或臨床治 療上反應依然相當顯著。 討論1 n1. Cytochrome oxidase V1b：基因向上調控粒腺體能 量代謝轉譯mRNA，使位於粒腺體內膜上呼吸酵素複 合物IV-即細胞色素氧化脢活性增加，促進粒腺體呼 吸鏈複合物V (即ATPase)合成ATP。 n中醫內經陽虛則外寒，陰虛則內熱：陽虛 顯示致病機轉在細胞發電廠-粒腺體功能低下 ATP合成不足，身體

45、內骨骼肌所含粒腺體最多，肌肉 產能嚴重不足，臨床上即表現外寒。 n陰虛顯示“細胞內葡萄糖、脂類或胺基酸不足以 合成細胞所需物質” ，致粒腺體功能亢進，而肝 臟為體內主要製造工廠且含粒腺體次多，因此臨床 上易出現內熱。 討論2 n2.Mevalonate diphosphodecarboxylase雙磷酸脫羧脢： MDD位於細胞質內Peroxisomes，促進合成酯醇(sterol) 和膽固醇(cholesterol) ，此二者是製造皮質激素和性荷 爾蒙之原料。 n3. Adenine phosphoribosyltransferase腺甘磷酸核醣轉化脢 ：APRT此酵素缺乏遺傳疾病，大都將導致慢性腎炎 腎衰，甚至換腎後亦同樣發生間質性腎炎。酵素 APRT和腎氣、慢性腎炎腎衰關係有待研究。 n4.金匱要略“腎氣丸”：內經素問 “善補陽者，必於陰中 求陽，則陽得陰助而生化無窮”以六味地黃丸滋養腎 陰為基礎，僅用少量桂附以助腎陽補命火，說明