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1、一、实验目的,通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。,二、实验原理,细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。,三、实验菌株,含质粒载体pGEM-T的大肠杆菌（E. coli.）,四、实验用具和药品,实验用具 摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及塞子、离心管（1.5m
2、L）。,实验药品,五、实验步骤,方法：活化-扩增-离心-裂解-离心-抽提-沉淀-洗涤-溶解 （一）细菌繁殖 实验前2天晚上： 将冻存的菌株取出，划线接种于LB（amp）平板上， 置于37培养箱中，倒置培养至菌落长成。 实验前1天晚上： 从LB平板上挑取单个菌落，接种于6mlLB液体培养基（加入氨苄青霉素）中，37，过夜振荡（200r/min）培养。,（二）菌体收集 实验当天 ： 将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心2min； 弃上清,（三）碱裂解法提取质粒DNA 全套操作约需1小时，详细说明如下。 3. 加入250 l的Solution （含RNase A1）充分悬浮细
3、菌沉淀。 注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。 4. 加入250 l的Solution 轻轻地上下翻转混合56次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。 注）此步骤不宜超过5分钟。 5. 加入400 l的4预冷的Solution ，轻轻上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。 6. 室温12,000 rpm离心10分钟，取上清。 注）此时4离心不利于沉淀沉降。 7. 将试剂盒中的Spin Column（离心柱）安置于Collection Tube （收集管）上。 8. 将上述操作6的上清液转移至Spin Column中，12,000 r
4、pm离心1分钟，弃滤液。,9. 将500 l的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 10. 将700 l的Rinse（冲洗） B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。 11. 重复操作步骤10。 12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心1分钟。 13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60 l的灭菌蒸馏水或Elution Buffer（洗脱缓冲液），室温静置1分钟。 注）把灭菌蒸馏水或Elut
5、ion Buffer加热至60使用时有利于提高洗脱效率 14. 12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。,六、实验作业,按上述实验步骤提取质粒DNA。 思考本实验的关键步骤是什么？ 答：本实验的关键是溶液重悬须充分，溶液混合须温和。用binding buffer是为了增加洗脱柱对核酸的结合活性；wash solution是洗掉柱子里除核酸物质以外的杂质；而elution buffer就是最后把DNA从柱子上洗脱下来使用的溶液，一般是pH=8.0的TE，dd水也可以。,实验二 大肠杆菌的遗传转化,一、实验目的,通过实验了解原核生物实现基因转移的途径，掌握质粒DNA遗传转化的基本原理和操作方法。
6、,二、实验原理,转化（transformation）是指一种生物由于接受了另一种生物（或同种生物）的遗传物质，从而获得了后者的某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 用理化方法人工诱导细菌进入感受态的操作叫致敏过程。 目前应用较广的转化方法有两种：CaCl2转化法（化学转化法）和电转化法。 CaCl2转化法的原理是在低温（0）和低渗的CaCl2溶液中，菌体膨胀，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细菌细胞表面，经42短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物。,三、实验材料,质粒pGEM-T easy ：编码氨苄青霉素（Ampr）的
7、抗性基因 大肠杆菌（E.coli）DH5菌株：氨苄青霉素敏感型（Amp-）,四、实验用品,超净工作台、摇床 水浴锅、离心机 分光光度计、移液器及枪头 三角瓶（500mL、200mL） 离心管（50mL、1.5mL） 平板（Ampr、Amp-）、LB培养基 冰冷的CaCl2溶液、质粒DNA,0.1M CaCl2溶液配制： 称量1.11g无水CaCl2固体，溶于1000ml双蒸水中，高压灭菌或0.22um滤器过滤除菌。保存于4度冰箱中。 质粒的提取： 利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA。,五、实验步骤,（一）感受态的制备(此步骤已完成） 1、E. Coli涂布于平板（Amp-），37，培养12h；
8、2、挑取单菌落，转移至盛有200mL LB的500mL三角瓶中，37，振荡（200r/min）培养12h；,3、吸取1mL菌液，转移至盛有100mL LB的200mL三角瓶中，37，振荡（200r/min）培养23h，每隔0.5h测OD600值； 4、当OD600=0.30.4（对数生长期的OD600=0.6）取出；冰上放置1060min； 5、4，5000rpm，离心10min，弃上清； 6、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 10mL悬浮细胞； 7、冰上放置15min； 8、4，5000rpm，离心10min，弃上清； 9、冰预冷的0.1mol/L CaCl2 2mL悬浮细胞； 10、用
9、于转化实验；若需保存，加入终浓度15%的甘油，-70保存。,（二）转化（冰上操作） 1、1.5mL管中加入感受态细胞50L和待转化的质粒2L，冰浴30min； 2、42热击90sec（勿晃动管子）； 3、冰浴2min； 4、加入37预热的LB至1mL； 5、37，振荡（50r/min）培养2h； 6、取200L涂板（Ampr），37培养12-16h； 7、对生长出的白色菌落计数，计算出每微升质粒的转化率。,六、实验作业,计算出大肠杆菌的转化率，转化率 = 平板上的白色菌落数2L。 转化过程中，会不会出现假阳性的结果，为什么？如何排除？ 答：转化过程中，经常出现假阳性。原因很多，如质粒、菌株不纯
10、，载体自连等。详细的解释见分子遗传学。,准备工作,1、培养板和菌株准备 实验前2天：制备LB液体培养基，LB固体培养基（含amp）若干（每组一个LB平板）、灭菌TEbuffer（或双蒸水） 将冷冻的pGEM-T载体菌株取出，划线接种至LB平板（amp）。 培养前1天，培养18-24h后，挑单菌落接种至LB液体培养基（含amp）。 若需制备感受态，时间同上，另需准备LB平板。 2、 0.1mol/L CaCl2 需提前配制，高压灭菌。氨苄青霉素工作浓度50ug/ul，一般是每ml培养基加入1ul氨苄青霉素。 3、制备碎冰，用于冰浴 4、eppendorf管、枪头（蓝、黄、白）、试管进行灭菌处理 5、移液器：实验室的50-250ul移液器 6、42度水浴锅、恒温摇床,