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1、,(1)目的基因的获取 目的基因：编码蛋白质的结构基因。 目的基因的获取途径 a.从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库或cDNA文库中获取。,一、基因工程的操作步骤,b人工合成目的基因：根据已知的核苷酸序列，利用原料以化学方法合成。常用的方法有反转录法和化学合成法。 c利用PCR技术扩增目的基因 通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量的目的基因。,(2)基因表达载体的构建(基因工程的核心) 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，并能够表达和发挥作用。,基因表达 载体组成,目的基因 启动子：为RNA聚合酶识别和结合部位，驱动转录mRNA 终止子：使
2、转录终止的特殊结构的DNA片段 标记基因：可鉴别受体细胞是否含有目的基因,过程,(3)将目的基因导入受体细胞 导入原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 导入过程,农杆菌转化法(主要)、基因枪法和花粉管通道法,显微注射技术,Ca2处理法,体细胞,受精卵,原核细胞,将目的基因插入Ti质粒的TDNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的DNA表达,将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物,Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,(4)目的基因的检测与鉴定 导入检测：DNA分子杂交技术(即使用放射性同位素或荧光分子标记的DNA
3、作探针进行检测)。DNA和DNA之间，看是否出现杂交带。,转录检测：分子杂交技术，DNA和mRNA 之间，看是否出现杂交带 翻译检测：抗原抗体杂交，看是否出现 杂交带,表达检测,个体生物学水平鉴定。例如：抗虫或抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性程度；对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同。,1.从“基因表达”层面理解基因表达载体的必需元件 (1)基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点。 启动子：RNA聚合酶识别和结合位点，启动转录。 终止子：终止转录的位点。 目的基因：其表达需要调控序列启动子和终止子。,拓展提升,(2)基因表达载体的构建
4、过程,2.区分一个至多个限制酶切点与每种酶一个切点 （1）一个至多个限制酶切点：作为载体必须具有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 （2）每种酶一个切点：因为某种限制酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。一个载体若只有某种限制酶的一个切点，则酶切后既能把环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。,二、基因工程的应用,(1)植物基因工程,抗虫转基因植物 减轻农药对环境的污染 抗病转基因植物 抗逆转基因植物,(2)动物基因工程,提高动物生长速度 改善畜产品的品质 用转基因动物生产药物 用
5、转基因动物作器官移植的供体 基因工程药品的生产,(3)基因治疗,把正常基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用,作用,体外基因治疗 体内基因治疗,基因工程与蛋白质工程的关系,三、细胞工程的原理和应用,动、植物细胞全能性 (1)原因： 生物体的每个细胞都含有发育成完整个体所必需的全部基因。 (2)全能性表现的大小： 受精卵的全能性最大，其次是生殖细胞，体细胞相对较小。,(3)全能性表现与细胞种类有关： 离体的植物体细胞的全能性在一定条件下可充分体现。离体的动物体细胞，全能性受到限制，但其细胞核仍具有全能性，需要借助卵细胞的细胞质才能体现出来。未离体细胞的全能性不能表达，只能在机体调控下定向分化
6、。,(4)细胞的全能性是植物细胞工程技术的理论基础。,2植物体细胞杂交与动物细胞融合的比较,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性,用纤维素酶、果胶酶去除细胞壁后，诱导原生质体融合,用胰蛋白酶使细胞分散后，诱导细胞融合,离心、电刺激、振动、显微操作、聚乙二醇等诱导,与植物体细胞杂交相比，还可用灭活的病毒诱导,克服远缘杂交不亲和的障碍，扩展杂交亲本范围，培育新品种,制备单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素等,3.动物细胞培养与植物组织培养的比较,固体,液体,水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、激素、琼脂等,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等,新的植株或组织,新的细胞系或细胞株,植株快速繁殖脱毒植株的培人
7、工种子生产药物、杀虫剂等转基因植物的培育,蛋白质生物制品的生产皮肤移植材料的培育检测有毒物质生理、病理、药理学研究,植物幼嫩的部位或花药等,动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织,均为无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件,诱导植物体细胞的原生质体融合的方法主要有离心、振动、电激或用聚乙二醇作为诱导剂。 动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒（诱导动物细胞融合的特有因素）、电激等。,拓展提升,1.容易混淆的三种细胞杂种细胞、重组细胞和杂交细胞 (1)杂种细胞：植物体细胞杂交过程中，两种细胞去掉细胞壁之后形成的原生质体融合，融合的原生质体形成细胞壁之后形成的细胞叫杂种细胞。 (2)重组
8、细胞：体细胞的细胞核移植到去核卵母细胞之后形成的细胞叫重组细胞。 (3)杂交细胞：动物细胞融合形成的细胞常称为杂交细胞。,2.植物体细胞杂交和动物细胞融合的结果及原理 (1)植物体细胞杂交 过程：a.植物细胞融合;b.杂种细胞的植物组织培养。 结果:形成杂种植株，产生了一个生物体。 原理：细胞膜的流动性和细胞的全能性。,(2)动物细胞融合 结果：动物细胞融合形成杂交细胞，杂交细胞进行细胞培养，获得大量的克隆细胞，但没有形成生物体。 原理：细胞增殖和细胞膜的流动性，不包含细胞全能性。,3.克隆动物与试管动物认识的误区 (1)误区一：试管动物与克隆动物的产生都是无性生殖。 纠正：试管动物的产生是有性生殖，克隆动物的产生是无性生殖。 (2)误区二：试管动物(哺乳类)的产生是在体外进行的，克隆动物(哺乳类)的产生是在体内进行的。 纠正：试管动物(哺乳类)和克隆动物(哺乳类)早期胚胎之前都是在体外进行的，早期胚胎经过胚胎移植之后是在体内进行的。,(3)误区三：胚胎移植的优势是充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，因此胚胎移植的胚胎只能来自体内受精的胚胎。 纠正：胚胎移植的胚胎有三个来源：体内正常受精产生的胚胎、核移植产生的重组细胞培养而来的胚胎、体外受精产生的早期胚胎。,