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1、问 题,如何知道每升血液中红细胞、白细胞、血小板的数量？ 如何知道水样中某小型生物的数量？ 如何知道发酵液中啤酒酵母的密度？ 如何知道生物制剂生产罐中细胞的密度？,实验目的,学习机械分离法获得动物组织的活细胞 学会使用血球计数板测定细胞悬液的细胞密度 掌握活细胞和死细胞的鉴别方法,收集动物组织的活细胞,从组织中分离单细胞的方法有多种： 对于较为柔软的组织（如肝脏、脾脏），可以采用机械研磨的方法分离细胞，但这会造成一些细胞的损伤而降低细胞的成活率； 对于比重差异较大的细胞，可以采用离心的方法来分离，例如血液中各种血细胞的分离； 对于股骨中骨髓细胞的分离，则可以采取冲洗股骨腔的方法获得。,实验材料
2、,小鼠 小鼠的抓法： 从鼠笼内将小鼠尾部抓住并提起，放在磁盘上或报纸上。,小鼠的处死：颈椎脱位法 右手（左手）抓住鼠尾用力向后拉，同时左手（右手）拇指与食指用力向下按住小鼠头部，在颅骨基部的后侧与颈椎两侧，施加压力，使头颅和脑一起与脊髓分离。当脊髓与脑分离时，伴有大量的肌肉活动。经研究证明，这种方法能使实验动物对痛觉不再敏感。,脾脏淋巴细胞悬液的制备,1.机械分离法 用镊子将脾脏置于尼龙布上，用注射器推棒轻轻挤压组织，使细胞分散。将尼龙布置于玻璃漏斗中，用D-Hanks 液冲洗尼龙布，收集细胞悬液于离心管中。 2.低渗溶解红细胞（红细胞溶血） 0.87% NH4Cl 溶液,股骨骨髓细胞悬液的制
3、备,冲洗骨髓腔 ： 用剪刀剪开股骨的一端，将注射器针头插入股骨开口端。然后用剪刀剪开股骨的另一端，用D-Hanks液多次冲洗骨髓腔，收集细胞悬液于离心管中。,D-HANKS液(无钙镁离子的HANKS液) 配方,NaCl 80.0克 Na2HPO42H2O 0.6克 （如为12H2O，则需1.2克） KCl 4.0克 KH2PO4 0.6克 双蒸水 1000毫升 原液稀释10倍即为使用液- D-Hanks液,细胞计数和细胞存活率,利用单细胞悬液进行实验研究时，通常需要确定细胞悬液的细胞密度和活细胞的数量，这就要进行细胞计数和细胞存活率的测定。 细胞计数一般用血球计数板，细胞存活率的测定一般采用染
4、色法。 细胞密度：每ml细胞悬液中的细胞数 细胞成活率：总细胞中活细胞所占的百分比,血球计数板的结构,血球计数板是特制的厚载玻片，中央区域有四条凹槽而形成三个平台，中间平台较宽，它又被一短横槽分隔为两部分，每一部分均有一个方格网。,每一方格网可分为九个大方格。 四角4个大方格分别被分为16个中方格。 中央大方格分为25个中方格，每个中方格又可分为16个小方格。中央大方格共含有400个小方格。,双线分隔,血球计数板的原理,白细胞计数法采用四角4个大方格的区域，适用于细胞较大数量较少的样品 红细胞计数法采用中央大方格的区域,血球计数板的原理,计数室大方格边长为1mm，面积为1mm2，中间平台与盖玻
5、片之间的距离（高）为0.1mm，所以每个大方格的固定容积为0.1mm3。,血盖片,计数室,血球计数板的计数公式1,每个大方格的总体积为0.1mm3 1 ml =1000 mm3, 0.1 mm3 = 10- 4 ml 每角大方格的细胞数10000 = 细胞数/ml 4角大方格中细胞总数 细胞密度= 104 4 稀释倍数= 细胞数/ml悬液,计数规则,位于格线上细胞只计上边线和左边线上的， 即“数上不数下，数左不数右” 由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。,注意事项,向血球计数板加样前，须将细胞悬液充分摇匀； 加样过程中，应避免将细胞悬液滴在盖玻片（血盖片）上，避免有气泡产生； 细胞悬
6、液密度过大时，应适当稀释后再计数 。,加样处,细胞密度的结果记录,在10的低倍镜下计数，细胞为透亮的小圆点。,细胞成活率的测定,利用染色法，判断细胞的死活； 活细胞的细胞膜具有选择通透性，不能被 台盼蓝染色，呈无色透明状； 死细胞的细胞膜通透性增大，被染成蓝色； 细胞总数死细胞数 细胞存活率= 100% 细胞总数,在载玻片上操作,注意事项,应在短时间内完成细胞存活率的测定，否则活细胞会被染料毒死而着色，影响实验结果的准确性； 应在几个视野下计算死活细胞的数量，避免人为因素的干扰； 可以在40倍的高倍镜下，计算视野中的细胞总数和其中的死细胞数。,细胞成活率的结果记录,血球计数板的计数公式2,中央
7、大方格的总体积为0.1mm3 中央大方格的细胞数1000 = 细胞数/ml 5个中方格中细胞总数 细胞密度= 25 104 5 稀释倍数= 细胞数/ml悬液,每一方格网可分为九个大方格。 中央大方格分为25个中方格，每个中方格又可分为16个小方格。中央大方格共含有400个小方格。,双线分隔,实验报告,实验过程中将原始数据记录在实验讲义中； 在实验报告纸上进行实验数据的计算和结果分析； 回答问题； 阅读文献资料。,成 绩,每次实验报告均打分并累计为平时成绩； 如发现实验报告和作业的抄袭，抄袭者和被抄袭者的成绩均记为0分。,显微镜的组成部分,调节瞳间距调节屈光度,所需物镜、 聚焦,5、,4、,1、,40X 物镜,观察,6、,明场观察, 观察步骤,思 考,本次实验要解决什么问题？ 采用什么方法来解决这些问题？ 还能用其他什么方法来解决这些问题吗？ 应用这些方法还能解决什么问题？,