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1、1、掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征 2、学习细菌的革兰氏染色原理和方法 3、了解细菌的特殊形态结构：芽孢和荚膜 5、学习训练无菌操作技术。,实验目的, 细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。,实验原理,1 细菌的简单染色, 常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。,实验原理 (continued), 常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱
2、性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。,1、菌种,枯草芽孢杆菌1218h培养物 金黄色葡萄球菌24h培养物,2、染色剂,石碳酸复红染液,实验材料,菌悬液,滴加无菌水,取菌苔,操作步骤,涂片,固定,干燥,染色水洗,干燥镜检,1、涂片,取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取）生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。 如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。 Notes: 1） 载
3、玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。,操作步骤（continued）,3、固定,固定的目的： 1）使细胞质凝固，以固定细胞形态； 2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。,固定方法： 涂面朝上，通过火焰数次 注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜， 否则会改变甚至破坏细胞形态,操作步骤（continued）,2、干燥 室温自然干燥,4、染色, 将玻片平放于桌面上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 石碳酸复红染色约1min。,操作步骤（continued）,5、水洗,倒去染液，用洗瓶（或自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止。 Note
4、: 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。,7、镜检,一般使用油镜（100倍）观察细菌个体形态。,操作步骤（continued）,6、干燥,自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。,Notes: 必须等涂片完全干后才可滴加香柏油 油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头,涂片,干燥,固定,染色,水洗,干燥,镜检,操作步骤,无菌操作,3）擦油镜镜头方法： A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油 B）用擦镜纸沾少许乙醚酒精（二甲苯），擦拭镜头； C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的乙醚酒精。,操作步骤（continued）,单染色法只能观
5、察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。 复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。 2、革兰氏染色 常用的有： 革兰氏染色法、芽孢染色法、抗酸染色法等。,G细菌细胞壁,G-细菌细胞壁,细菌细胞壁的结构,G菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。,G菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。,G+和G-细胞壁的对比,革兰氏染色的实验原理,结晶紫初
6、染,碘液媒染,乙醇脱色,番红复染,涂片固定,革兰氏染色的步骤,1. 涂片 2. 初染：滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约1520秒后，立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染35分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果并绘图。,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.,Figure 2 - Gram stain of Gram E
7、. coli cells,3 枯草杆菌芽孢的染色,枯草芽孢杆菌（24h培养物） 1、制备菌液：加4-6滴蒸馏水于小试管中，用接种环从斜面挑取菌体3-5环于试管中充分混匀。（7人一组） 2、染色：加孔雀绿5滴于小试管中。 3、加热：沸水浴，15-20分钟。 4、涂片：用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上，制成涂片。 5、干燥、火焰固定 6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。 7、复染：加复红染色1-2分钟，水洗，吸水纸吸干。 、镜检：10x ，40x 、100X（油镜）观察。,4 细菌荚膜的染色,荚膜,负染色法：胶质芽胞杆菌 1、制片：取洁净的载玻片一块，加一滴黑墨水，取少量的菌体放入
8、墨水滴中混匀并涂片。 （也可用刮片法：另取一载玻片，以三十度角将其边缘浸入黑素中向右端拖动，将黑素涂成一薄层。） 2、镜检：10x ，40x 物镜观察（注意物镜不要接触黑素，不要用油镜观察）,实验报告,1、细菌简单染色、革兰氏染色的原理、方法和步骤。 2 记录所观察到的染色结果，并绘图 2、思考题 1）制备细菌染色标本时应注意哪些环节？ 2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？ 如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？ 3）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？ 4）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？ 要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？哪一步是关键？Why?,本次实验课结束 请确保油镜头擦拭干净！,本次实验安排,每人: 简单染色两片:枯草芽孢杆菌(1218h)培养物,金黄色葡萄球菌 革兰氏染色两片:金黄色葡萄球菌,大肠杆菌 芽孢染色1片:枯草芽孢杆菌（24h培养物） 细菌荚膜染色1片:胶质芽胞杆菌,