显微镜油镜使用和细菌形态观察-文档资料.ppt

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1、目 的 要 求,学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护的基本知识 使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造,显微镜的构造 1.光学部分:接目镜 、 接物镜 、 照明装置(聚光镜、 虹彩光圈、 反光镜等). 它使检视物放大,造成物象. 2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件.它起着支持 调节 固定等作用.,显微镜油镜使用的原理,显微镜油镜使用的原理,显微镜的放大倍数和分辨率 1.放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为： D=/2nsin(/2 ) 式中D：物镜分辨出

2、物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。,显微镜油镜使用的原理,油镜使用的原理 1. 香柏油的折射率与玻璃接近，提高了视野的照明度。 2 . 提高了显微镜的分辨率,实 验 材 料,显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。 细菌三型、金黄色葡萄球菌、链球菌、变形杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、破伤风梭菌、炭疽杆菌、园褐固氮菌、霍乱弧菌等固定装片,实验程序（显微镜的使用）,主要是油镜的使用 1.用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 2.调节光亮度 3.低倍镜观察：粗调、细调 4.依次再进行中倍、高倍观察 5.油镜观察：高倍

3、镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 6.换片：另换新片，必须从第三条开始操作。 7.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。,实验程序（显微镜的使用）,显微镜保养和使用中的注意事项： 1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观

4、察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,实验程序III,细菌基本形态和特殊构造的的观察： 1. 利用油镜，结合细菌三型等染色片观察细菌的基本形态（球状、杆状和螺旋状），边观察边绘图。 2. 观察细菌的特殊构造： 变形杆菌、绿脓杆菌-示鞭毛 破伤风梭菌、枯草杆菌-示芽孢 园褐固氮菌-示荚膜,金黄色葡萄球菌,基本形态的观察,链球菌,霍乱弧菌,大肠杆菌,特殊构造的观察,变形杆菌,鞭毛,特殊构造的观察,圆褐固氮菌,

5、荚膜,特殊构造的观察,破伤风梭菌,枯草芽孢杆菌,芽孢,思 考 题,油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 使用油镜时，为什么必须用镜头油？ 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？,实 验 一,结 束,实验二 细菌的革兰氏染色,目的要求 革兰氏染色原理 实验材料 实验程序 思考题,目 的 要 求,1.初步掌握细菌涂片方法 2.学习并掌握革兰氏染色法步骤,革兰氏染色的基本原理,根据细菌细胞壁的组分和结构不同，通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为两大类G+和G-,革兰氏染色是丹麦医生 C.Gram（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。,实

6、 验 材 料,金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)斜面培养物 大肠杆菌(E.coli)培养物,涂片制备过程,革兰氏染色的过程 制片,革兰氏染色的过程 染色,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,革兰氏染色注意载玻片要洁净，滴无菌水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚；热固定温度不宜过高，（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态；水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，过大，以免涂片薄层脱落。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。 美蓝染色注意染液不宜过多或过

7、少，否则在盖上盖玻片的时,菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察；同样，盖玻片的不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。 霉菌直接制片注意挑菌和制片时要小心，尽可能保持霉菌的自然生长状态，加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。,注意事项,实验报告,1绘图说明经革兰氏染色后大肠肝菌和金黄色葡萄球菌的染色结果。,实验报告,2思考题： 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。 你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。 进行革兰氏染色时，为

8、什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色出现什么问题？ 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？,实验三,培养基的制备和灭菌,一、目的要求,学习和掌握各种培养基的制备方法，其中包括培养基的配制，包扎及灭菌技术。 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,二、基本原理,培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因子以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能表现它们最大

9、生命力，因此不同种类的微生物应将培养基调到一定pH值范围。培养基种类很多，不同的微生物所需培养基不同。按其组成可分合成培养基和天然培养基。按其物理状态可分固体培养基，液体培养基和半固体培养基。按其特殊用途可分加富培养基，选择培养基、鉴别培养基。,培养基配制后还必须进行灭菌。灭菌和消毒是二个不同含义的名词。消毒是指消灭病原菌或有害微生物，而灭菌则是杀死或消灭一定环境中的所有微生物。,消毒与灭菌的方法很多，但总的可分为物理法与化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌与湿热灭菌），过滤灭菌、紫外线灭菌等。化学方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其它物体表面进行灭菌与消毒。,三、实验材料

10、,每组同学需要准备以下材料： 小试管：12支（15*150mm） 培养皿：12套（9cm） 吸管：3支（1ml） 三角玻扒：2支 烧杯：1套（50ml，100ml，250ml，500ml） 量筒：1个（100ml） 玻棒：1支 分液漏斗：1套 药匙：2把 剪刀：1把 铁丝：数支 标签贴纸：1张 铅笔：1支 10ML玻璃吸管：1支,四、实验内容,（一）、培养基的配制： 同学们先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。 注意：标签用铅笔书写，以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹。 操作图示：,培养基配方：,四、实验内容,肉汤培养基：营养肉汁1g 自来水50ml PH7.

11、2 麦芽汁培养基：麦芽汁5g 自来水50ml 自然PH 固体培养基：由液体培养基加2琼脂,1配制肉汤斜面培养基50 mL 将小烧杯置天平上，用药匙取营养肉汤干燥培养基，称取1 g先加少量自来水，溶解彻底再转移到量筒，定容至50ml，然后倒在250 mL烧杯里，加入琼脂1g（2%），浸泡于液体培养基里，液面位置做好标记，在电炉上加热融化后（注意补充蒸发的水分以保持原体积不变），用分液漏斗分装6支小试管，每支5 mL左右（约试管高度的1/5左右）， 用硅胶塞塞好试管口，再用防潮纸和棉绳将试管塞罩住扎成一捆。 用漏斗分装培养基及摆斜面 2配制麦芽汁斜面培养基（方法同上）,四、实验内容,3注意事项：

12、本实验使用调配好的“干燥培养基”，这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法，真空干燥法，低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理，充分混匀，便成干燥粉末而成。使用时只要按比例加入一定量的水，经溶解，无需调pH，分装，高压蒸汽灭菌，即可使用。 “干燥培养基”成品很容易吸潮，在称量时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。瓶盖也不要盖错。 在烧杯融化琼脂的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。注意带上棉纱手套防止烫伤。 分装过

13、程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞而引起污染。,四、实验内容,（二）培养基灭菌 培养基分装好后，塞上棉塞，外面再包一牛皮纸，便可灭菌。灭菌的时间和温度按各培养基规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分。培养基经灭菌后，可放在37恒温箱培养24小时，无菌者方可使用。 在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌。一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌，而玻璃器皿常用干热灭菌。蒸汽灭菌为105-121，15-20分钟，干热灭菌为160-170，1-2小时。目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 在同一温度下，湿热杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分

14、，使蛋白质易于凝固，同时湿热穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。,四、实验内容,高压蒸汽自动灭菌锅,手提式高压蒸汽灭菌锅,（三）包扎 1培养皿：以旧报纸密密包紧，一般以6套做一包，待灭菌。 2吸管：在距其粗头顶端约0.5cm处，塞一小段1.5cm长的棉花。棉花要塞得松紧恰当（过紧，吹吸液体太费劲；过松，吹气时棉花会下滑），然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端，与报纸约呈60角，并将右端多余的报纸打一小结。 3三角玻扒：跟包扎吸管相似，将三角部分斜放在报纸条的近左端，与报纸约呈45角，并将右端多余的报纸打一小结。,四、实验内容

15、,1.灭菌器内加入一定量的水，将用防水纸包扎好的物品放入其中。 2.接通电源，进行加热。 3. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀；或关闭排气阀，待压力上升到0.5kg/cm2时再打开排气阀，待压力回复到0时再关闭排气阀。 4.当压力达15bl/in2（即1.05kg/cm2）时，此时灭菌器内的温度为1210C，维持30min。对热不稳定的培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物时，应适当降低压力，延长时间。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。,四、实验内容,（四）灭菌,四、实验内容,（四）放置斜面,五、实验报告,思考题：

16、培养基应具备哪些条件? 在培养基配制操作过程中应注意什么问题?为什么? 培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养 基是无菌的? 高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压?高压蒸汽灭菌 前为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽?灭菌完毕后什么情况下 才可以开锅盖取出灭菌物品? 玻璃器皿为什么在灭菌前要先行干燥? 对含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培养基进行高压蒸汽灭菌时， 应采用多大压力，多长时间灭菌为宜? 加热蒸汽灭菌为什么比干热灭菌所要求的温度低、时间短？ 干热灭菌完毕后，在什么情况下才可开箱取物？为什么？,实验四,细菌大小的测定,一、目的要求,学习测微尺的使用和计算方法 利用测微尺测量微生

17、物的大小,二、基本原理,微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、平板计数法、光电比浊法等。 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具即测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。,三、实验材料,酵母菌液 显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺 3. 载玻片、盖玻片、接种环、胶头吸管等,四、实验内容,注意事项：观察时光线不宜过强,否则难以找到镜台测微尺的刻度;换高倍镜和油镜校正时

18、,务必十分小心,防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。 1.测微尺的校正（标定）： 两重合线间镜台测微尺格数10 目镜测微尺每格长度(m)= 两重合线间目镜测微尺格数 2酵母菌大小的测定： 利用制好的血球器浸片，用高倍镜测出宽和长各占目镜测微尺的格数，再将测到的格数乘以目镜测微尺（用高倍镜时标定的）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。,五、实验报告,（1）将目镜测微尺校正结果填入下表: 接目镜放大倍数：-10-,五、实验报告,(2)将酵母菌大小测定结果填入下表：,五、实验报告,2.思考题： 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测 定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么

19、？ 为什么更换不同放大倍率目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重 新对目镜测微尺进行校正？,实验五,微生物数量的测定,一、目的要求,1明确血细胞计数板计数的原理 2掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。,二、基本原理,微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、平板计数法、光电比浊法等。 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。,三、实验材料,酵母菌液

20、显微镜、血球计数器 3. 盖玻片、毛细管等,Thoma血球计数板 A.正面图 B.纵切面图 1.血球计数板 2.盖玻片 3.计数室,16小格 25大格计数室,25小格 16大格计数室,计数室的两种刻度形式,四、实验内容,一.酵母菌数量的检测（显微镜直接计数法） 注意事项: 取样时先要摇匀菌液;加样时计数室不可有气泡产生。 B. 调节显微镜光线的强弱适当。,1. 取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。 2. 取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液自行渗入，计数室内不得有气泡。 3. 静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。 4. 在高倍镜下计数：随机计数五个中格

21、的平均值，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。,四、实验内容,5. 计算方法： 6. 注意事项：压在方格线上的菌体，以压在底线和右侧线上的菌体计入本格内；遇到有芽体的酵母时，若芽体和母体同等大，就按单个酵母计数。 7. 计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。,四、实验内容,五、实验报告,1、结果记录： 将计数结果记录下表。A表示五个中方格中的总菌数。B稀释倍数为102。,注:1 mL菌液总数=A/525104B=5107A,五、实验报告,1、思考题： （1）在显微镜下直接测定微生物

22、数量有什么优缺点？ （2）根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？ （3）某单位要求知道一种干酵母粉的活菌存活率，请设计1-2种可行的检测方法。,实验六,微生物接种,一、目的要求,训练微生物接种的基本技能 基本建立无菌操作的概念,二、基本原理,接种技术是微生物学实验及研究中的一项最基本的操作技术。接种是将纯种微生物在无菌操作条件下移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。为了获得微生物的纯种培养（指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代），要求接种过程中必须严格进行无菌操作，一般是在无菌室内，超净工作台火

23、焰旁或实验室火焰旁进行。,根据不同的实验目的及培养方式可以采用不同的接种工具和接种方法。常用的工具有接种环、接种针、接种铲、玻璃涂棒，移液管及滴管等。常用的方法有斜面接种，液体接种，穿刺接种和平板接种，这些方法在后面的实验一一进行训练。,三、实验材料,1各组所需的物品 接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机， 标签贴纸，废物杯，一次性口罩，纸巾。 准备移植的菌种：参考下列接种菌名（由老师提供） 斜面培养基：肉汤培养基（6支），麦芽汁培养基（6支） 2注意事项： 酒精不足的酒精灯请自行添加！注意：添加量不得超过容量的2/3。 将所有空白斜面贴好标签，注明接入菌种的名称，接种班

24、别，接种组别， 接种日期。 接种前请将台面用抹布清洁，擦干；双手用洗手液清洁，擦干。 斜面接种，分清菌台和培养基，挑取少量菌种，切勿划破培养基。 接种时要关闭门窗，风扇，人不要随意走动，端坐，平缓呼吸。 不同的菌种，不同的接种方式，使用不同的接种工具（针，钩，环，吸管）。,四、实验内容,1微生物的斜面接种技术： 从已长好微生物的菌种管中挑取少许菌苔接种至空白斜面培养基上的过程。 斜面接种的操作方法： （1）操作前，先用75%酒精擦手，作表面消毒，待酒精挥发后才能点燃 酒精灯。（可通常是点燃酒精灯再用酒精擦手。） （2）用斜面接种时，将菌种管和斜面管握在左手的大拇指和其他四指之 间，使斜面和有菌

25、种的一面向上，并处在水平位置。 （3）先将菌种管和斜面管的试管塞旋转一下，以便接种时便于拔出。 （4）右手拿接种环，拿的方式与普通日常拿笔一样。将要伸入试管部分 的金属柄和金属丝在酒精灯火焰上灼烧灭菌。 （5）用右手小指、无名指或手掌将菌种管和斜面管的试管塞同时拔出， 并把塞子握住，不得任意放在桌上或与其他物品接触，再以火焰烧 管口。,（6）将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内，使接 种环在接种菌种前先在试管内壁上或空白培养基接触 一下，使接种环充分冷却，以免烫死菌种然后用接种 环在菌落上轻轻地接触，刮取少许后将接种环自菌种 管内抽出。抽出时勿与管壁相碰，也勿使再通过火焰。 （7）迅速将沾

26、有菌种的接种环伸入斜面培管中，在斜面上， 自下而上划线，使菌种沾附在培养基上，划线时勿用 力，否则会使培养基表面划破。 （8）接种完毕后将接种环抽出，灼烧管口，塞上试管塞。塞 试管塞时勿要用试管口去迎试管塞，以免试管在移动时 侵入杂菌。 （9）接种环在放回原位前，要经火焰灼烧灭菌。同时须将试 管塞进一步塞紧以免脱落。,接种菌名及接种划线方式、接种工具： 细菌：枯草杆菌，大肠杆菌，单球菌，谷氨酸菌，假单孢杆 菌，巨大芽孢杆菌（6支） （接种方式：“之”字划线，接种工具：接种环） 霉菌：黑曲霉，黄曲霉，根霉（3支） （接种方式：点植或划直线，接种工具：接种钩或接种环） 酵母菌：面包酵母菌，古巴酵母

27、菌，假丝酵母菌（3支） （接种方式：划直线，接种工具：接种环）,图4 11 各种无菌操作接种技术示意图,图4 11 各种无菌操作接种技术示意图,各种无菌操作接种技术示意图,穿刺接种操作过程示意图,将接种好的斜面试管置最适合该菌种生长的恒温培养箱里。 一般细菌于37恒温培养箱培养1-2d 一般霉菌和酵母菌于32恒温培养箱培养2-3d,2生物的培养技术 培养箱恒温培养法,五、实验报告,1观察记录实验结果:微生物琼脂斜面上的生长状况。 2思考题: 接种环(针)接种前后灼烧的目的是什么?为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断灼烧过的接种环已冷却? 培养不同种类微生物能否用同一种培养基?为什么?细菌、酵

28、母菌、霉菌通常用什么培养基培养？,实验七,微生物的分离纯化,一、目的要求,学习从混杂的微生物群体中分离与纯化微生物菌种的方法。 综合练习微生物学实验的各种无菌操作技术,二、基本原理,自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。 微生物的分离、纯化技术是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。微生物的平板分离纯化技术自1880年被发明以来以有100多年的历史，该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动物细胞培养等方面的应用作出了巨大的贡献。平板稀释涂布、平

29、板稀释混合、平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。 分离纯化技术其实是进行平板接种，即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。平板接种的目的是观察菌落形态，分离纯化菌种，活菌计数及在平板上进行各种实验时采用的一种接种方法。 本实验是利用分离纯化技术来获得三大类微生物的平板纯培养物，为下次实验微生物的形态观察提供菌落形态的部分（形态观察主要包括群体形态（菌落形态）和个体形态观察两个方面。,三、实验材料,1、各组所需物品： 无菌培养皿：两包，12套 无菌三角玻扒：1支 无菌吸管：3支 接种器具：酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，圆珠笔，

30、 一次性口罩，纸巾。 制平板的培养基：肉汤琼脂培养基（1瓶）, 麦芽汁琼脂培养基（1 瓶） (于杀菌锅里保温) 2、平板的制备： 将融化的琼脂培养基,冷却至50左右(以手背能忍受的温度为准)温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于45时，培养基易于凝固而无法制作平板。 平板的制作应在酒精灯火焰旁进行，右手掌心握住三角瓶的底部，左手打开三角瓶棉塞，以右手的无名指和末指夹持瓶塞，灼烧瓶口。左手拿培养皿，用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15 mL,厚度约0.5 mL左右），迅速盖好皿盖。 左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平

31、位置,待凝后即为平板。,四、实验内容,1. 土壤稀释液的制备,四、实验内容,2. 平板混合分离法： 将土壤悬液分离样品摇匀，用无菌移液管取1 ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15 ml，摇匀，凝固，制成平板。 混合倒平板操作法示意图,四、实验内容,3. 平板划线分离法： 将土壤稀释样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙（约30）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种

32、环面成30-40，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。,平板划线分离操作法示意图,平板划线菌落分离效果图,4. 平板涂布分离法(3皿)： 将0.1ml土壤稀释液小心地滴在平板培养基表面中央位置。右手拿无菌三角玻扒在平板培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直来回推动,平板内边缘处可改变方向用三角玻扒再涂布几次。,四、实验内容,涂布平板操作法示意图,四、实验内容,5. 生物的培养技术：培养箱恒温培养法 细菌

33、于37恒温培养箱培养1-2d，平板倒置培养。 霉菌和酵母菌于32恒温培养箱培养2-3d，平板 倒置培养。,五、实验报告,1、观察记录实验结果：微生物的菌落特征 注:菌落特征描写方法参考如下： 大小：大，中,小,针尖状 形态：圆形，不规则等 干湿情况：干燥，湿润，粘稠 高度：扁平，隆起，凹下 透明度：透明度，半透明，不透明 颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，黑色等 边缘：整齐，不整齐,2、思考题: 如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤. 你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落?如果不是,请分析其原因。 在恒温培养箱中培养微生物时为何培养皿需倒置?,五

34、、实验报告,放线菌和真菌形态的观察,放线菌和真菌形态的观察,目的要求 实验材料 实验程序 思考题,目的要求,学习观察放线菌和真菌形态的基本方法 加深理解放线菌和真菌的形态特征,实验材料,放线菌和真菌培养物 1. 放线菌培养物：青色链霉菌（Streptomyces glaucus）或“5406”产生菌（St. microflacus）四天培养物。 2. 啤酒酵母（Saccharomyces cervisiae）24至28h液体培养物或斜面培养物。 3. 黄曲霉（Aspergillus flavus）4d平面培养物。 4. 各种真菌示范片。 显微镜、载玻片、接种环、解剖针、解剖刀、酒精灯、镊子等。

35、 乳酚油、碘液、酒精、蒸馏水等。,实验程序,观察放线菌链霉菌的形态 观察酵母菌的形态 观察霉菌的形态,实验程序（观察放线菌链霉菌的形态）,个体形态直接观察法： 观察菌丝和孢子丝自然生长的性状，其中包括气生菌丝（较粗），基内菌丝（较细）和孢子丝的形状，如分枝状况及孢子丝的卷曲等，并绘图说明。 印片染色法： 印片 微热固定 石炭酸复红染色1min 水洗 晾干 镜检。（示范片）,实验程序（观察放线菌链霉菌的形态）,插片染色法： 280C插片培养46d，轻轻取出盖玻片，进行固定、染色、水洗、晾干、镜检。观察方法同“直接观察法”，观察基内菌丝、气生菌丝及孢子丝的卷曲状况，及分生孢子的形状，绘图加以说明（

36、本实验采用青色链霉菌接种后观察）。,实验程序（观察酵母菌的形态）,观察酵母菌形态和无性繁殖： 用高倍镜观察啤酒酵母的形态和出芽繁殖。 酵母肝糖染色法： 在洁净的载玻片上滴一小滴路哥氏碘液（Lugol），取一环酵母菌液与碘液混匀，盖上盖玻片，镜检，菌体呈淡黄色，肝糖粒呈红褐色。在高倍镜下观察菌体形态、出芽、芽簇、肝糖粒，并绘图。 酵母脂肪粒染色法： 在洁净的载玻片上加一滴，取一环啤酒酵母与福尔马林混匀，静止5min，加1滴美兰染色液，10min后再加一滴苏丹染色液，盖上盖玻片，镜检。原生质呈兰色，脂肪粒呈粉红色，而液泡无色。（示范片）,实验程序（观察霉菌的形态）,观察黄曲霉菌丝分隔情况和分生孢子

37、着生情况（着重辨认分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子）：在洁净载玻片中央加一滴酒精，用接剖针挑取黄曲霉培养物少许放入其中，再加入酒精和蒸馏水各一滴（重复一次），使分生孢子分散，便于观察。倾去酒精和蒸馏水，加一滴乳酚油（防止细胞变形和气泡产生，又可防止干燥以保持较长时间），盖上盖玻片，镜检、观察、绘图。 用同样方法制取青霉（Penicillium sp.）封片，示范片，观察菌丝有无分隔和分生孢子梗、小梗、及分生孢子排列方式，并绘图。 用同样方法制取镰刀霉（Fusarium sp.）封片，示范片，观察孢子丝和着生部位的构造，并绘图。,实验程序（观察霉菌的形态）,取黑曲霉（Rhizopus niger

38、）5d平板培养物，用其皿盖，在低倍镜下观察菌丝体形态（假根、匍匐菌丝、孢囊梗及孢囊等）并绘图。 更好的是采用载片培养法，可制成永久的封片，更便于保存。 做蘑菇切片。观察担子菌担子着生情况及其孢子的形态等，示范片，并绘图。 观察梨头霉（Absidia sp.）或根霉的接合孢子，示范片，并绘图。,看录象,真菌的有性孢子和无性孢子及其结构 实验室平菇的栽培,思考题,在用放线菌菌苔直接观察气生菌丝和孢子丝的形态时，要注意些什么？ 在制取酵母菌的水浸片时，要注意哪些要点？ 制取酵母水浸片时为什么不用水，而用乳酚油？,结 束,实验九,微生物的生理生化反应,一、目的要求,了解不同细菌对含氮及含碳化合物的分解

39、和利用情况 进一步掌握微生物的接种方法,二、基本原理,微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生理生化反应作用作为重要依据。 本实验分别安排微生物对生物大分子的分解利用（淀粉水解实验水解试验、明胶液化试验），对含碳化合物的分解利用（糖发酵试验）以及对含氮化化合物的分解利用（吲哚试验），让同学们对微生物的代谢类型多样性有一个初步和感性的了解，同时学习利用微生物形态、结构以及生化反应的特征对某些细菌

40、进行初步的分类。 本实验进一步学习平板接种法、穿刺接种法、液体接种法。,三、实验材料,1培养基： 淀粉水解培养基：2皿 明胶液化培养基：2支 糖类发酵培养基：4支 蛋白胨水培养基：2支 接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，废物杯，一次性口罩，纸巾，油性笔。 实验菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、单球菌 4. 配置培养基的工具：1套,四、实验内容,糖类发酵试验,四、实验内容,1. 淀粉水解试验：（2皿） （1）翻转平板使底皿背面向上，用油性笔在其背面玻璃上画上三 个圆圈。 （2）用接种环在圆圈中间以点植的方式接上菌种。一皿接枯草杆 菌，另一皿接大肠杆菌。 （3）将接完种

41、的平板倒置于37恒温培养箱，培养24h。 （4）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻 旋转，是碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明 圈，则说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小，说明该 菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外酶活力的高低。（以 “+”、“”表示有无透明圈）,四、实验内容,（1）以穿刺接种法分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于明胶培 养基中。 （2）接种后置于20恒温培养箱，培养2-5d。 （3）观察结果时，注意培养基有无液化现象。（以“+”、 “”表示有无液化现象） 注意： 如果细菌在20时不能生长，则必须培养在所需的最适温度下，观察结果时需将试管从恒温箱里取出，置于

42、冰浴中，才能观察液化程度。,2. 明胶液化试验：（2支）,四、实验内容,（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于 同种糖类培养基中，以作比较。 （2）接种后置于37恒温培养箱，培养24h。 （3）观察结果时，看各管颜色变化及杜氏小管有无气 泡。产酸产气用“”表示；只产酸不产气用“+”表 示；不产酸也不产气用“”表示。,3. 糖类发酵试验：（4支）,四、实验内容,（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于蛋 白胨水培养基中。 （2）接种后置于37恒温培养箱，培养24h。 （3）观察结果时，在培养液中加入乙醚约1毫升（使呈明显 的乙醚层）。充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片 刻，

43、待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚 试剂10滴。如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色 注意：加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显）。以“+”、“”表示有无红色的玫瑰吲哚。,4. 吲哚试验：（2支）,五、实验报告,1. 细菌对各种生理生化试验反应的原理：,五、实验报告,2细菌对各种生理生化试验反应的结果：,五、实验报告,（1）淀粉、明胶等生物大分子物质能否不经分解而直接被细菌吸 收？为什么？ （2）接种后的明胶试管可以置于37恒温培养箱箱中培养，在培 养后你必须做什么才能证明水解的存在？ （3）假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什 么结果？ （4）解释在细菌培养中吲哚试验

44、的化学原理，为什么在这个试验 中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？,2. 思考题,实 验 十,水中微生物的检测,一、目的要求,了解食品卫生微生物学的重要性及其原理 学会水中细菌菌落总数的测定方法和平板活菌计数法 3. 学会水中大肠菌群数的测定方法,二、基本原理,水和食品中的微生物数量主要考虑到的是细菌特别是病原菌的数量。这些细菌主要来源于土壤、垃圾、粪便等，尤其是后者。若饮用水、酿造水和食品中发现有大肠群细菌，就有可能存在肠道病原菌，可能会危害人们的健康，因此，进行食品卫生的微生物学检验是十分重要的。 一般情况下，主要是测定水和食品中细菌菌落总数和大肠菌群数。细菌菌落总数是指

45、水中或食品检样经处理后，在一定条件培养后，所得1 g或1 mL检样中所含细菌菌落的总数，其主要作为判定水和食品被污染程度的标志。大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多的一群细菌、常将其作为人畜粪便污染的标志。水和食品中大肠菌群数是以每100 mL（g）检样中大肠菌群最可能数（MPN）表示的。,三、实验材料,水样的采取： 池水，河水或湖水应距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出,最好立即检查,否则需放入冰箱保存,时间不要超过六小时。 2. 其他实验材料参考实验讲义,四、实验内容,（一）、水中细菌

46、菌落总数 用平板菌落计数法测定（即菌种分离纯化技术的平板混合法） 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品的一个单细胞.统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以,长成的一个单菌落也可能来自样品中2-3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果,现在已倾向使用菌落形成的单位(colony-forming units,cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。,食品检样稀释及倾注平板示意图,四、实验内容,2水中大肠菌群数: 用多管发酵法测定.包括初(步)发酵试验,平板分离和复发酵试验三个部分(略) 发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基,并倒置一杜氏发酵小管.乳糖能起选择作用,因为很多细菌不能发酵乳糖,而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气.为便于观察细菌产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂,细菌产酸后,培养基即由原