专题1基因工程”和“专题2细胞工程-PPT文档.ppt

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1、,1.主要内容归纳 2.重难点突破 3.达标训练,内 容 纲 要,专题1 基 因 工 程,1.基因工程的理论基础和概念的理解,2.明确基因工程所需三种基本工具的作用,4.简述基因工程的基本操作程序,3.理解基因工程的原理和技术,5.能列举出基因工程在植物、动物、医疗领域的具体应用及取 得的丰硕成果,6.简述其基本原理及基本途径,学 习 目 标,本 章 知 识 网 络,基因工程,理论基础和概念,基 本 工 具,基因的剪刀限制性核酸内切酶 基因的针线DNA连接酶 基因的运载工具运载体,1.获取目的基因 2.构建基因表达载体 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定,基 本 操 作 程

2、序,基因工程的应用（略）,蛋白质工程（略),1.时间：,2.理论基础：,（1）_是生物遗传物质的发现。,（2）_结构的确立。,20世纪70年代,（3）_传递方式的认定。,3.技术上的保障：,限制性核酸内切酶、_和_载体的发现与应用,DNA,DNA双螺旋,遗传信息,DNA连接酶,质粒,（一）基因工程的理论基础和技术,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,（二）基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物

3、体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切, 拼接, 导入, 表达,基 因 重 组,1.限制性核酸内切酶“分子手术刀” (1)来源: (2)化学本质： (3)作用 (4)作用特点： (5)切割方式,（三 ） 基因工程的操作工具,催化作用,所以可重复利用,可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割,错位切：产生两个相同的黏性末端,平切：形成平末端,主要是从原核生物中分离纯化出来的,蛋白质,特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点,主要切割外源DNA，而对自身的DNA不起作用，达到保护自身的目的,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，

4、他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,举例：大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A 之间切开形成黏性末端，Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平末端 。,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。,注意： 切割的化学键为磷酸二酯键。 在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶, 目的是产生相同的黏性末端。 将一个基因从DNA分子上切割下

5、来,需要2个限制 酶,同时产生4个黏性末端。 不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末 端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶产生的 黏性末端一般不相同。,2.DNA连接酶“分子缝合针”,作用实质：使两个DNA的单链末端之间形成磷酸二酯键而连接成一个DNA,2、“分子缝合针” DNA连接酶,磷酸二酯键,DNA连接酶能封闭DNA双螺旋骨架上的切口，不能封闭缺口,例 限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶的切点。,请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。,例 限制性内切酶的识别序列和切点是GGA

6、TCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶的切点。,请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末端。,例 限制性内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶的切点。,能。上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，所以能连接起来。,在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,3.基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,(1)类型 (2)功能： (3)应具备条件,最常用载体:质粒,其

7、他载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒等,提醒 质粒本质是DNA,不是细胞器;特点:小型环状。,将目的基因导入受体细胞。,能在宿主细胞内稳定保存并大量复制；,有一个至多个限制酶的切割位点,以便于与外源 基因连接；,有特殊的遗传标记基因,供重组DNA的检测和鉴定。,能够自主复制并稳定地保存。,对受体细胞无害。,质粒：,质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。 质粒是基因工程最常用的运载体。 绝大多数细菌质粒都是闭合环状DNA分子。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。,大肠杆

8、菌质粒的分子结构示意图：,“标记基因”,质粒一般有几个到几百个基因，控制细菌的抗药性、固氮、抗生素生成等性状.,例题： 3.下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是（ ） A.将单个核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸 二酯键 B.将断开的两个DNA片段的骨架连接起来，重新 形成磷酸二酯键 C.连接两条DNA链上碱基之间的氢键 D.只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接 起来，而不能将双链DNA片段平末端之间进行 连接,B,（四）基因工程的基本操作程序,1.基因工程图解:抗虫棉的培育过程,可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上,（四）基因工程的基本操作程序,(1)目的基因的获

9、取 (2)基因表达载体的构建最核心步骤 (3)将目的基因导入受体细胞 (4)目的基因的检测与鉴定,从基因文库(基因组文库或cDNA文库)中获取,2.基 本 操 作 程 序,(1)目的基因的获取,人工合成目的基因:常用的方法有化学合成法和 反转录法。 化学合成法:蛋白质 氨基酸序列 RNA 碱基序列 DNA碱基序列 用4种脱氧核 苷酸人工合成目的基因 反转录法:分离出供体细胞mRNA 单链DNA 合成目的基因（具体过程如下）,cDNA 合 成 过 程,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链

10、降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,利 用 PCR 技 术 扩 增,PCR技术聚合酶链式反应,原理： 前提： 条件：,PCR扩增仪,DNA双链复制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,DNA的两条链为模板,温度控制和缓冲液,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,指数,2n,结果：,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物。,引物：一小段单链DNA或RNA，一般2030个碱基

11、，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。,PCR扩增技术与DNA复制的比较,(2)基因表达载体的构建最核心步骤 基因表达载体的组成:启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。,注意：与载体相比较,增加的启动子、目的基因和 终止子三个基因片段,其功能各不相同。 启动子(DNA片段)起始密码子(RNA);终止子 (DNA片段)终止密码子(RNA)。 基因表达载体的构建方法 提醒 该过程把三种工具(只有两种工具酶)全用 上了,是最核心、最关键的一步,在体外进行。,(3)将目的基因导入受体细胞,基因工程唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。 微生物做受体细胞主要是个体微小,代谢旺盛, 繁殖速度快,获得目的

12、基因产物多。 植物细胞还可用基因枪法和花粉管通道法。 (4)目的基因的检测与鉴定,目的基因的检测与鉴定,检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,例题： 1.下列有关基因工程技术的叙述,正确的是（ ） A.重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶 和载体 B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸 序列 C.选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌 繁殖快 D.只要目的基因进入受体细胞就能实现表达,C,2.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所 需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了 在受体细胞中表达的是 （ ） A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B大肠杆菌中检测到人

13、胰岛素基因及其mRNA C山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白,D,课 后 作 业,见附件,专题2 细 胞 工 程,植 物 细 胞 工 程,1、理解植物细胞的全能性 2、了解植物细胞脱分化和再分化的结果 3、掌握植物组织培养的特点 4、理解植物体细胞杂交和植物细胞培养的联系 5、掌握微型繁殖和植物组织培养的联系 6、掌握作物脱毒、人工种子的制备过程和意义,学 习 目 标,植物细胞工程,概念,原理：生物学原理和分子生物学原理 水平：细胞整体水平或细胞器水平 目的：改变细胞内的遗传物质，获得细胞产品,细胞的全能性：概念、原因、大小,植物组织培养,过程：外植体愈

14、伤组织胚状体植物体 脱分化：形成愈伤组织 再分化：植物细胞选择性表达，形成胚状体 特点：子代与亲代性状高度遗传,去细胞壁：纤维素酶、果胶酶 诱导剂：PEG 融合完成的标志：新细胞壁的形成 过程：原生质体融合+组织培养,植物体细胞杂交,知 识 网 络,一 植物组织培养及细胞全能性 1.操作流程及培养条件 (1)操作流程 (2)培养条件：营养物质(水、无机盐、蔗糖、氨 基酸和有机酸等)、激素(如细胞分裂素、生长素 等)及其他条件(无菌、适宜的温度和pH等)。,注意 幼嫩的组织脱分化较为容易,如茎尖、 根尖、形成层细胞易脱分化,而植物的茎、叶和成 熟的组织则较难。 对外植体要进行消毒处理,而对各种器

15、械要彻底 灭菌。 植物组织培养中用到的有机碳源一般为蔗糖,用 葡萄糖也可以,但后者的成本高。 诱导愈伤组织再分化形成胚状体或丛芽及生根 的过程中,要进行换瓶处理,以改变培养基中的激 素配比及浓度。,2.脱分化和再分化的比较,3.原理：全能性 (1)含义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整 个体的潜能。 (2)物质基础：生物的每一个细胞都包含有该物种 所特有的全套遗传物质,都有发育成完整个体所必 需的全部基因。 (3)在生物体内细胞并没有表现出全能性的原因 基因在特定的时间和空间条件下选择性表达,细胞 分化为不同的组织、器官。 (4)全能性的实例 花药的离体培养、植物的组织培养、克隆技术等。,二

16、 植物组织培养技术的应用 1.植物繁殖的新途径 (1)微型繁殖：不仅可以保持优良品种的遗传特性, 还可以高效快速地实现种苗的大量繁殖。 (2)作物脱毒：生产上许多无性繁殖作物均受到病 毒的侵染,从而导致品种严重退化、产量降低和品 质变差。利用植物分生组织(如茎尖、根尖)进行 培养,可以使新长成的植株脱除病毒。 (3)人工种子：植物组织培养得到的胚状体、不定 芽、顶芽或腋芽,包上人工种皮就可以形成人工种 子。,2.作物新品种的培育 (1)单倍体育种：花药离体培养过程就是植物组织 培养过程。 单倍体育种的优点是后代不发生性状分离,都是纯 合子,能够稳定遗传,明显缩短了育种年限。 (2)突变体的利用

17、：在植物组织培养过程中,由于 培养细胞一直处于不断的分生状态,因此容易受到 培养条件和外界压力(如射线、化学物质等)的影,响而发生突变。从这些产生突变的个体中可以筛 选出对人们有用的突变体,进而培育成新品种。 (3)细胞产物的工厂化生产：可以利用植物组织培 养技术大量生产某些细胞产物,如蛋白质、药物、香料等,例题 某优良品种水稻的基因型为AaBb，其花药通过组 织培养形成了试管苗。下列对这一培养过程的叙 述，错误的是 （ ） A.花粉形成试管苗要经过脱分化和再分化的过程 B.试管苗有四种基因型，其体细胞含有一个染色 体组 C.通过该过程培养出的试管苗还不能直接用于生产 D.这些试管苗自交，后代

18、性状不发生分离,D,三 植物体细胞杂交 1.技术流程 2.疑难解读 (1)植物体细胞杂交的障碍 植物细胞都有细胞壁。根据酶的专一性原理,用 纤维素酶和果胶酶去除细胞壁。 原生质体融合。人工诱导方法包括物理法,如离,心、振动、电激;化学法,如聚乙二醇(PEG)等。 (2)杂种细胞的类型 有三种：AA、BB、AB,符合要求的只有AB,需要进 行筛选。 (3)杂种细胞AB形成的标志：新的细胞壁的生成。 (4)杂种植株遗传物质的变化：细胞融合属于染色 体变异,杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染 色体数目之和,形成异源多倍体。 (5)植物体细胞杂交的原理：原生质体融合的过程 利用了细胞膜的流动性,杂种

19、细胞发育成杂种植株 利用了细胞的全能性。,3.该技术的目的 植物体细胞杂交的终点是培育成杂种植株,而不是 形成杂种细胞就结束。杂种植株特征：具备两种 植物的遗传特征,原因是杂种植株中含有两种植物 的遗传物质。 4.该技术在育种上应用时最大的优点 克服远缘杂交不亲和的障碍。 5.未解决的问题 目前还不能让杂种植物完全按人们的需要去表达 亲代的优良性状,如番茄马铃薯。,下列关于细胞工程的叙述 错误的是 ( ) A.电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞 融合 B.去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单 个细胞均需酶处理 C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞 融合可制备单克隆抗体 D.某

20、种植物甲乙两品种的体细胞杂种与甲乙两品 种杂交后代的染色体数目相同,D,专题2 细 胞 工 程,动 物 细 胞 工 程,一 动物细胞培养技术 二 动物细胞融合与单克隆抗体 三 动物体细胞核移植技术与克隆动物,学 习 目 标,动物细胞工程,知 识 网 络,动物细胞培养技术,动物细胞培养的操作流程,培养条件,原理,单克隆抗体的操作流程,动物细胞融合与单克隆抗体,动物体细胞核移植技术与克隆动物,动物细胞融合操作流程,动物体细胞核移植技术操作流程,原理：动物细胞核的全能性 卵母细胞选择时期及原因,1.动物细胞培养的操作流程 2.知识梳理 (1)培养条件 无菌、无毒的环境无菌处理、加抗生素杀 菌、定期更

21、换培养液。,一 动物细胞培养技术,营养葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐和微量 元素+血清或血浆等天然成分 温度和pH(36.50.5)和(7.27.4) 气体环境95%空气+5%CO2 注意CO2作用调节培养基pH 空气中O2作用细胞有氧呼吸 所用装置CO2培养箱 (2)原理：细胞增殖 (3)动物细胞培养时,一般选取幼龄动物的组织、 器官,其细胞的分化程序较低,增殖能力强,有丝分 裂旺盛,容易培养。,(4)在动物细胞培养过程中,一般情况下10代以前 的细胞核型不变,10代以后有些细胞核型发生改 变,50代以后的细胞可能发生癌变。 (5)胰蛋白酶在动物细胞培养过程中的作用包括将 组织分散成单个

22、细胞,以及将贴壁细胞从瓶壁上分 离下来,这样做的目的是避免动物细胞的接触抑制 现象。,例题 1.关于动物细胞培养的有关叙述，正确的是( ) A.细胞的癌变发生于原代培养向传代培养的过渡 过程中 B.动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、 无机盐、生长素和动物血清等 C.动物细胞培养的目的只是获得大量的细胞分泌 蛋白 D.动物细胞培养前和培养过程中都要用胰蛋白酶 处理,D,二 动物细胞融合与单克隆抗体 1.单克隆抗体的操作流程,2.知识梳理 (1)诱导融合的2种细胞名称及作用 免疫过的B淋巴细胞(浆细胞)产生抗体; 骨髓瘤细胞无限增殖。 (2)诱导融合与原生质融合的不同方法 动物细胞诱导融合的

23、特有方法灭活病毒诱导。 (3)2次筛选的目的及方法 在特定的选择性培养基上,未融合的亲本细胞 (浆细胞和骨髓瘤细胞)和融合的具有同种核的细 胞(BB融合细胞、瘤瘤融合细胞)都会死亡,只有融合的杂种细胞(杂交瘤细胞)才能生长。这种杂种,细胞的特点是既能迅速大量繁殖,又能产生单一的 特异性抗体。 经选择性培养的杂交瘤细胞并非都是能分泌所 需抗体的细胞(很多种杂交瘤细胞),需经克隆化培 养和抗体检测,经多次筛选后就可获得足够数量的 能分泌所需抗体的细胞。 (4)2个培养提取场所 体外培养培养液提取。 体内小鼠腹腔中培养小鼠腹水中提取 (5)原理：细胞膜的流动性和细胞增殖。,例题 3.利用细胞工程方法

24、，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗 原制备出单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 （ ） A.用纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，产 生的血清抗体为单克隆抗体 B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得大量针对SARS 病毒的单克隆抗体 C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经PEG诱 导融合后的细胞均为杂交瘤细胞 D.利用该单克隆抗体与SARS病毒核衣壳蛋白特异 性结合的方法可诊断出病毒感染者,D,三 动物体细胞核移植技术与克隆动物 1.动物体细胞核移植技术操作流程 2.知识梳理 (1)原理：动物细胞核的全能性(不能说动物细胞全能性)。 (2)卵母细胞选择时期及原因 减中期的卵母细胞,此时具备受精能力,细

25、胞质中合成与分裂分化有关的物质能刺激融合后重组细胞进行分裂分化,形成重组胚胎。,(3)选卵细胞做受体细胞原因 大,易于操作;卵黄多,营养丰富,为发育提供 充足的营养;激发重组细胞分裂分化。 (4)供体细胞：取供体动物的体细胞培养,一般选 用传代10代以内的细胞,因为10代以内的细胞一般 能保持正常的二倍体核型,保证了供体细胞正常的 遗传基础。 (5)动物体细胞不能经培养直接发育成完整个体,原因是动物体细胞的全能性受到限制。用体细胞 核移植技术能够得到克隆动物,说明动物体细胞的 细胞核具有全能性。 (6)该过程用到的技术手段：动物细胞培养、动物 细胞融合、早期胚胎培养和胚胎移植。 (7)核移植产生的克隆动物与提供细胞核的亲本不 同的原因 克隆动物细胞质基因来源于另一个亲本。所以 与植物组织培养不同(只来自于一个亲本),克隆动 物遗传物质来自2个亲本。,在发育过程中可能发生基因突变,染色体变异导 致性状改变。 外界环境条件的影响引起不可遗传的变异。,例题 1.下列哪项不属于体细胞核移植技术的应用（ ） A.加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育 B.保护濒危物种 C.获得组织器官异体移植的供体 D.大量产生紫杉醇,D,