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1、 生物材料 DNA mRNA 一定大小范围DNAPCR cDNA（互补DNA） 反转录 基因组文库 cDNA文库 基因文库 包括 人工合成 限制酶切割 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 得到转基因生物 目的基因检测与鉴定 第一步 第二步 第三步 第四步 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 生物材料 PCR cDNA mRNA DNA 基因组文库 cDNA文库 一定大小范围DNA 人工合成 逆转录 限制酶切割 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 得到转基因生物 目的基因检测与鉴定 第一步第一步 第二步第二步 第三步第三步 第四步第四步 基因文库(gene library)概念 u
2、又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA 或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转 化宿主细胞，通过筛选后得到大量的阳性菌 落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为 该生物的基因文库。 u基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞 组成。 mRNA 结构图 DNA 结构图 基因组文库(Genomic library) 将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内 切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA 片段，再与合适的载体在体外重组并转化相 应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。该文库 以DNA片段的形式贮存着该生物全部基因组 的信息，可用于分离目的基因和保存某种生 物的全部基因。 基因组文库 c
3、DNA文库 (cDNA library) 提取某生物组织或发育时期的总mRNA，经反转 录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存 于受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA 文库。 cDNA(complementary DNA，互补DNA)：是由生 物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。 结构基因 外显子 内含子 转录、加工修饰 mRNA cDNAcDNA文库文库 反转录酶 cDNA 克隆、转化、培养、鉴定克隆、转化、培养、鉴定 构建基因文库的基本程序 1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段 ，或提取组织或器官的mRNA并反转录成
4、cDNA； 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA； 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 4)阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。 基因组DNA文库 cDNA文库 基因组文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库（ 细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库） 。 基因组文库的质量标准 一个理想的基因组文库应具备下列条件： u重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； u载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； u克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利于克隆 排序； u克隆片段易于从载体分子上完整卸下；
5、 u重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。 cDNA文库的主要优点 cDNA文库特别适用于某些RNA病毒的基因组结 构研究及有关基因的克隆分离； cDNA文库较小，易于筛选； cDNA文库可用于在细菌中表达真核生物的基因 ； cDNA文库结合基因组文库可用于真核细胞mRNA 的结构和功能研究。 cDNA克隆的主要的缺点 cDNA文库所包含的遗传信息远少于基因组DNA 文库，并且受细胞来源或发育时期的影响； cDNA文库不能直接获得基因内含子序列和基 因编码区外大量调控序列的结构与功能方面 信息； 在cDNA文库中，高丰度mRNA的cDNA克隆所占 的比例比较高，分离起来比较容易，而低丰 度mRNA的
6、cDNA克隆所占的比例则比较低，因 此分离也就比较困难。 从基因文库中筛选目的基因 1.通过克隆序列筛选：核酸杂交(探针）和PCR（ 引物） 2.通过表达产物筛选：免疫学检测（抗原抗体反 应） 探针 探针是一小段带标记的单链DNA或者RNA片 段（大约是20到500bp）， 用于检测与其互 补的核酸序列。 最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射 自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针 法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂 交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识 别，从而显示出位置。 菌落原位杂交法（核酸杂交） 直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上, 经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤
7、 膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选 出含有目的序列的菌落。 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。 特点： PCR筛选法 利用合适的引物，以从初选出来的阳性 克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对 PCR产物的电泳分析，确定目的基因序列所 在克隆。 免疫筛选法 放射性抗体检测法 滤膜（固定抗体） + 免疫沉淀检测法 菌落 沉淀素 高等生物的基因组DNA十分复杂,单个基因在基因 组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很 小。因此，要想从庞大的基因组中分离某个特定 的未知基因非常困难，因此先把材料DNA分成若 干易于处理的片段，然后确定目标序列在哪一片 段，再进一步从该
8、片段寻找目标序列，事情就变 得容易了。 为什么要建 基因文库？ PCR法获取目的基因 已知基因： 设计合成一对引物，直接从基因组DNA（或文库 ）中扩增该目的基因。 未知基因： 参照其他物种中该基因的两末端设计引物，从基 因组DNA（或文库）中扩增该目的基因； 依照其他物种中该基因的保守区段序列设计引物 ，扩增出一段DNA，标记为探针，从基因组文库 、cDNA文库中钓出该基因。 PCR法获取目的基因的前提是：要有足够制备 合适引物的信息 PCR法获取目的基因优点 1.简便快速：在有足够引物信息的情况下，可直 接从基因组DNA中克隆目的基因，大大减少了基 因分离的工作量； 2.灵敏度高：可从极微
9、量的模板扩增出目的片段 ； 3.对起始材料质量要求低：由于其灵敏度高和特 异性强，极微量的材料或者混合的组织、部分已 降解的DNA材料都可以作为起始材料； 4.也可用于基因文库的构建。 化学合成制备目的基因 磷酸二酯法 亚磷酸三酯法 获取目的基因的方法 一般来说： 目的基因的获得通常采用PCR法；化学 合成法由于合成的片段较短，一般用于引物 和探针的合成；基因文库一般用于保存基因 资源。 目的基因检测与鉴定 通常采用分子杂交的方法。 分子杂交：采用已知标记的核酸分子或蛋白质分 子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子。 根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交（ DNA）、North
10、ern 杂交（RNA）和 Western 杂 交 （蛋白质）。 分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与 DNA的二条单链之间进行，也可以在蛋白质 与蛋白质之间进行。 核酸分子杂交是指核酸分子(DNA或RNA)在变 性以后，在复性的过程中两个不同来源的且 同源的核酸分子形成杂合双链的过程。 蛋白质之间的杂交通过抗原抗体反应进行。 通常通过各种方法将核酸（蛋白质）分子固 定在固相支持物上，然后用放射性元素等标 记的探针（抗体）与被固定的分子杂交，经 显影（显色）后显示出目的核酸（蛋白质） 分子。 Southern杂交的操作步骤 (1) 酶切DNA，凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA
11、原 位变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼 龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异 性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。 放射自显影 DNA印迹转移 探针杂交 将将RNARNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维 素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进 行核酸杂交的一种实验方法。行核酸杂交的一种实验方法。 Northern杂交 Northern杂交的过程 提取总RNA 分离mRNA，利用亲和层析的原理纯化mRNA。 制
12、备RNA探针，根据mRNA序列合成同源DNA探针， 或以cDNA为探针。 Northern杂交，通过显影检查目的DNA所在的位 置。 Southern杂交和Northern杂交过程示意图 Western杂交 中文一般称为蛋白质印迹技术。其基本原理 是通过特异性抗体对凝胶电泳分离的细胞或 生物组织蛋白样品进行检测。 Western Blot与Southern杂交或Northern杂 交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙 烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针 ”是抗体，“显色”用标记的二抗。 Western杂交过程 经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载 体（例如硝酸
13、纤维素膜）上，以固相载体上的蛋白 质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显 色或放射自显影以检测电泳分离的目的蛋白。根据 检测结果，从而可得知被检细胞内目的蛋白表达与 否、表达量及分子量等情况。 第一步 抗体识别抗原 第二步 第二抗体 识别第一抗体 第三步 颜色反应 Western杂交结果图 建立文库需要重组子的数目 N=ln(1-P)/ln(1-1/n) N：重组子数目； P：文库中包括任意DNA片段的概率； n：总基因组碱基数/克隆片段碱基数。 例：假如重组片段大小为20kb，要使文库包含该 基因组任一片段的概率达到99%，则 N大肠杆菌=
14、ln(1-0.99)/ln(1-1/4.6/20103)=1.1103 N人=ln(1-0.99)/ln(1-1/2.8/20106)=6.5105 常见载体容量 载体质粒 噬菌体 黏粒细菌人工 染色体（ BAC） 酵母人工 染色体（ YAC） 容量 （kb) 1023453501000 （二）细胞工程 细胞融合与单克隆抗 体 细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂 交（somatic hybridiazation），是指两 个或更多个相同或不同细胞通过膜融合， 形成单个细胞的过程。 细胞融合的意义 u理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生 物资源。这对于种质资源的开发
15、和利用具有深远的意义。 u绕开了种间生殖隔离的限制，为远缘物种间的遗传物质交换 提供了有效途径。 u体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统， 在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可 发生重组，从而产生新的核外遗传系统。 u淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。 显微镜下细胞融合过程 细胞融合的常用方法 一、灭活病毒法 两种细胞在一起培养，加入灭活病毒，在4条件下病毒 附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚； 在37中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环， 此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2； 细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP ；
16、融合成大细胞，需ATP 。 二、聚乙二醇（PEG）法 PEG PEG分子式：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分 子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂. PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极 性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键， 从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞 质膜发生粘连进而促使质膜的融合. PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低， 不需特殊设备；融合子异核率较高；融合过程不 受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能 对细胞有毒害。 三、电融合法 电融合法是在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的 氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间
17、 破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融 合体。 电融合法的优点： u融合率高，重复性强，对细胞伤害小； u装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录像观察融合过程； u免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。 细胞杂交瘤技术与单克隆抗体 抗体 由抗原刺激B淋巴细胞产生的，并能与 刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有 免疫功能的糖蛋白。 抗原决定簇 抗原分子中存在的能与抗体Fab片段特异性结 合的特殊化学基团，是免疫应答特异性的物 质基础。 构象决定簇与线性决定簇 单克隆抗体 定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识 别抗原分子某一特定抗原决定簇的高度特异 性的抗体。每种单克
18、隆抗体其分子结构完全 相同。 多克隆抗体 定义：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动 物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细 胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗 原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生 的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody, PcAb）。 单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定 抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂 交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖， 又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单 克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。 骨髓瘤细胞选择 骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 选择次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷 型（HG
19、PRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型 （TK-）瘤细胞 在旁路合成途径中，HGPRT负责催化磷酸核 糖焦磷酸和嘌呤基形成嘌呤单磷酸核苷酸， 而TK可催化胸苷转化为5-单磷酸胸苷，作为 胸苷脱氧核苷酸合成的材料。 HAT选择培养基 含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧 啶核苷（T）的培养基，是动物杂交细胞筛选 中最常用的方法。在这种培养基中细胞只能 利用旁路途径合成DNA，因而只有具有 HGPRT+或/和TK+的细胞才能生长。 细胞内DNA的合成途径 从头合成途径：以氨基酸和其他小分子起 始合成核苷酸，进而合成DNA 的过程；可被 叶酸类似物氨基蝶呤（A）阻断； 旁路合成途径：胸腺嘧啶脱氧核苷
20、激酶（ TK）利用胸腺嘧啶核苷（T）合成DNA；次 黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄 嘌呤（H）合成DNA。 单克隆抗体的大量制备 体内法：单克隆细胞注入到小鼠腹腔培养； 细胞培养：体外克隆培养. 单克隆抗体的应用 1. 作为亲合层析的配体 单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能 够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某 一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层 析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分 离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激 素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的 hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等 )相比，具有简便、
21、快速、经济、产品活性高等优点 。 2. 作为生物治疗的导向武器 将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药 物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向 作用，将化疗药物或放疗物质携带至靶器官 ，可直接杀伤靶细胞。 另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接， 注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿 瘤的诊断。 治疗用脂质体 3.检验医学诊断试剂 单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性 好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、 放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技 术，目前，应用单克隆抗体制作的商品化试 剂盒广泛应用于：病原微生物抗原、抗体 的检测；肿瘤抗原的检测；免疫细胞及 其亚群的检测；激素测定；细胞因子的 测定。 4. 作为研究抗原的探针 例如前面讲的Western blotting。 5. 作为免疫抑制剂 抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免 疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫 疾病和抗器官移植的排斥反应。注射抗小鼠 Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移 植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植 的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处 理，能减轻移植物抗宿主病的发生。