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1、提 纲 1、背景知识简介 2、定义及基本原理 3、所用抗体及标本类型 4、常用染色方法 5、操作步骤及结果判断 6、临床应用 7、相关图片 7、开展该项目注意事项 背景知识简介 l 免疫组化技术是20世纪70年代初Sterb Berger在酶标法的基础上,以免疫学的抗原 抗体反应为理论基础发展起来的一门方法 学。 l 20世纪80年代该项技术在国外开始应 用于诊断疾病，国内比国外约晚10年，即 90年代开始运用于疾病的病理诊断。 l 最近20多年来，该项技术得到飞速发展，特 别是绝大多数抗体能够应用在福尔马林固定的石 蜡切片上，因而大大促进了它在临床病理学上的 应用。 l 从开始发展至今，该项
2、技术一直在基础医学 和临床研究中发挥重要作用,为疾病尤其是肿瘤性 疾病的诊断、鉴别诊断及发病机制的研究提供了 强有力的手段。 l 目前绝大多数大中型医院都开展了该项技术 检查，我院有待开展此项技术。 定义及基本原理 定义： 免疫组化，也称为免疫组织化学技术或 免疫细胞化学技术，是应用免疫学基本原 理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性 结合的原理，通过化学反应使标记抗体的 显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素 ）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋 白质），对其进行定位、定性及定量的研 究。 基本原理： 抗体和抗原之间的结合具有高度的特异 性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先 将组织或细胞中的某种
3、化学物质提取出来， 以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获 得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或 细胞中的同类的抗原物质。然后再通过化学 显色方法将抗原抗体结合所在的部位显示出 来，从而达到对组织或细胞中的未知抗原 进行定性，定位或定量的研究。 有如下基本特点： 1、特异性强 2、敏感性高 3、定位准确 4、形态与功能相结合 所用抗体及标本类型 l所用抗体类型 常用的抗体为单克隆抗体和多克隆 抗体，单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆 分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术 免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后 的抗原直接免疫动物后，从动物血中所 获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆 所产生的抗体混合物
4、。 l所用标本类型： 主要为组织标本和细胞标本两大类， 前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片 ）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞 爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组 织标本最常用、最基本的方法，对于组织 形态保存好，且能作连续切片，有利于各 种染色对照观察；还能长期存档，供回顾 性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗 原暴露有一定的影响，但可进行抗原修 复，是免疫组化中首选的组织标本制作 方法。 常用染色方法 l 免疫组织化学技术按照标记物的种类不 同可分为： 1，免疫荧光法，标记物为荧光素，通 过荧光显微镜观察； 2，免疫酶法，以酶标记抗体，抗原抗 体反应后显色，通过光镜或电镜观察，目前 最
5、常用； 3，其它如亲和组织化学法、免疫铁蛋 白法、免疫胶体金法及放射免疫自显影法等 。 操作步骤 l流程简介如下： 常规石蜡切片脱蜡抗原修复（根据 需要）缓冲液冲洗（3min/2次）室温下 孵育5min缓冲液冲洗（5min/2次）室温 下孵育5min 缓冲液冲洗（5min/2次）滴 加一抗37孵育1-2小时缓冲液冲洗（ 5min/2次）室温下孵育30分钟滴加二抗 室温下孵育1小时缓冲液冲洗（5min/2次 ）滴加DAB液孵育3-5分钟自来水充分 冲洗复染脱水透明封片出诊断。 结果判断 （表达部位、检测物质及常用标记物） l表达部位： 细胞膜、细胞浆、核膜、细胞核、细胞 多部位及组织等； l检测
6、物质： 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原 的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖 、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体 等都可用相应的特异性抗体进行检测。 常用于肿瘤病理鉴别诊断的免疫标记物 （举 例） l上皮组织：CK、EMA； l特异性上皮标记：如TG、 PSA，TTF1 等； l间叶组织：vinmentin； l肌组织：desmin、SMA、MSA、myosin、 myogenin、myoD1； l血管内皮细胞：CD31、CD34、FVIIIRAg 或FVIII； l组织细胞：CD68、Mac387、溶菌酶等； l神经内分泌： 1、激素标记物：儿茶酚胺、5HT、多肽 和肽释放因子等； 2
7、、非激素标记物：NSE、CGA、Syn等； l神经组织： S100、MBP、Leu7、NSE、GFAP 、 NFP等； l淋巴造血组织：CD45（LCA）、CD20（ L26）、 CD79a、CD3、 CD45RO、 CD15、CD30、Bcl2、Sig(IgM和IgD) 等； l胚胎性抗原：CEA、AFP等； l细胞增殖抗原：PCNA、Ki-67等； l激素：ER、PR、AR等； l病毒：HBV、EBV、HPV等； l癌基因和抑癌基因：c-erBb-2、nm23、 P53、P16和Bcl-2等 临床应用 l免疫组化的临床应用主要包括以下几方面： 恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断； 确定转移性恶性肿瘤
8、的原发部位； 对某类肿瘤进行进一步的病理分型； 软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的 组 织学分类，因其种类多、组织形态相像， 有时难以区分其组织来源，应用多种标志 物进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断 是不可缺少的； l发现微小转移灶，有助于临床治疗方案 的确定，包括手术范围的确定。 l为临床提供治疗方案的选择。 小圆细胞肿瘤的免疫组化鉴别诊断 VimLCANSEDes S-100CgA 小细胞未分化癌 神经内分泌癌 神经母细胞瘤 / EWS/PNET / 胚胎性横纹肌肉瘤 恶性黑色素瘤 / 恶性淋巴瘤 梭形细胞肿瘤的免疫组化鉴别诊断 VimDes actin S-100FVIIIRAgCD34
9、al-ACT 平滑肌肉瘤 MPNST / 单相性滑膜肉瘤 / 纤维肉瘤 恶性纤维组织细 胞瘤 / / 梭形细胞血管肉瘤 胃肠道间质瘤 / / 梭形细胞恶性黑色素 瘤 梭形细胞癌 生殖细胞肿瘤免疫组化特点 KeratinVimCEAAFP HCGPLAP 精原细胞瘤 精母细胞性精原细胞 瘤 胚胎癌 卵黄囊瘤 绒毛膜上皮癌 畸胎瘤 淋巴造血组织肿瘤免疫组化鉴别诊断 LCACD20CD45ROCD56MPOVsc387CD15CD30KP-1lyso B细胞性淋巴瘤 + T细胞性淋巴瘤 + NK细胞淋巴瘤 + 间变性大细胞性淋巴 瘤 + + 浆细胞性恶性淋巴瘤 -/+ + 粒细胞肉瘤 + + 真性组
10、织细 胞性淋巴 瘤 _ + 霍奇金淋巴瘤 -/+ + 小B细胞淋巴瘤免疫组化特点 CD5 CD10 CD23 cyclinD1 BCLLSLL 淋巴浆细胞性淋巴瘤 滤泡性淋巴瘤 套细胞性淋巴瘤 淋巴结边缘 区细胞淋巴瘤 结外边缘区细胞淋巴瘤 （黏膜相关淋巴组织淋巴瘤 ） 垂体腺瘤的免疫组化鉴别诊断 LTHGHACTHPSH/LHFSHCgA NSEKER 泌乳素细胞腺瘤 生长激素细胞腺瘤 促皮质激素细胞腺瘤 促性腺激素细胞腺瘤 / 促甲状腺素细胞腺瘤 / 乳腺浸润性导管癌免疫组化分子分型 与治疗预后关系 ER PR HER-2预后 治疗有效药物 Luminal A 最好他莫昔芬 Luminal
11、 B 较较好他莫昔芬+阿那曲唑唑 Triple Negative 一般含铂药铂药 物+EGFR抑制剂剂 HER-2+ 最差曲妥珠单单抗 部分相关相关图片 免疫组化检测 P53在结直肠癌组织中的表达 SP400 P53在结直肠癌组织中肿瘤细胞胞核表达 l CEA COX2 l Ki-67 Bcl-2 cerBb-2 CD20 ER CK 开展该项目注意事项 l标本的固定方面 组织标本及时的取材和固定是做好免疫 组化染色的关键第一步，其可有效防止组 织自溶坏死，抗原丢失。离体组织应尽快 在20分钟内固定，固定时间在6-24小时之 间，固定液以选择10%的中性福尔马林为 宜。 l蜡块的选择方面 l修复方法的选择和对比方面 l设置阳性与阴性对照方面 l结果判读方面 谢谢！