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1、植物离体无性繁殖 简称离体繁殖（in vitro propagation)、微 型繁殖（micropropagation)，是指利用离体 培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶 片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养 ，并在短期内获得大量遗传性一致的个体的 方法（技术）。 用这种方法得到的植株群体来自一个单株（ 或一个单芽），它们遗传组成相同，这些株 群可称单株无性系。 近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无 子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广 泛应用。 植物离体无性繁殖的意义（优越性） 繁殖速度快，经济效益高 占用空间小，不受季节限制， 便于工厂化育苗 繁殖各种珍稀、涉危苗木和 突变体

2、，为育种服务 离体繁殖周期： 13个月 繁殖系数：几十 几百倍 又称快繁 离体繁殖是建立在 体细胞系的基础上 ，是在人工控制的 环境条件下，不会 造成性状分离，也 不会退化，同时还 可避免病虫害的侵 染。 手指玫瑰 植物离体无性繁殖的方式 器官发生型(organogenesis type) 胚状体发生型(embryogenesis type) 不定芽型（adventitious bud type) 器官型(organ type) 原球茎型(protocorm type) 球茎芽型 块茎型 鳞茎型 孢子型 根茎型 微枝扦插型 器官发生型(organogenesis type)： 诱导器官外植体产

3、生愈伤组织，经分化培 养形成芽、根再生成植株的方式。 技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早 期挑选，使其来源尽量一致。 特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再 生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。 芦荟、烟草、油菜等 无菌母株制备 增殖、分化 植株再生及鉴定 炼苗和移植 基本程序与技术 培养基中激素配比 激素种类及浓度 基本培养基组成 渗透压 逐步过渡 培养基筛选 材料灭菌 芦荟组织培养快速繁殖 材料和培养基 1015cm高的芦荟幼苗 愈伤组织诱导培养基 MS(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA 分化培养基 MS(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA 生

4、根培养基 MS(0.1-0.5mg/L)IBA+(2-5mg/L)多效唑 繁殖方法 愈伤组织培养 外植体：茎尖 外植体消毒：酒精升汞 培养基：愈伤组织诱导培养基 培养条件：温度 252 光照 10002000lx 1012h/d 培养时间 1525d （形成愈伤） 繁殖方法 继代培养 种子 愈伤切块 培养基及条件 同愈伤组织培养 培养时间 1030 分化培养 种子 愈伤切块 培养基 分化培养基 培养条件 同愈伤组织培养 培养时间 3050d （出芽，叶） 生根培养 材料 3cm高的幼苗 培养基 生根培养基 培养条件 同愈伤培养 培养时间 15d 炼苗 选材 苗高510cm，健壮 清洗培养基，喷

5、水 条件 15 25，6080湿度，1224h 移栽 移入驯化苗圃（蛭石组成） 1520d 移入苗圃 胚状体发生型(embryogenesis type)： 指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱 分化形成胚状体再成苗的方式。 技术关键：提高不同外植体胚状体发生及 萌发率和提高胚状体同步化率。 特点：胚状体发生数量多、速度快、结构 完整，繁殖系数高；遗传性稳定。 甘蔗、胡萝卜、石刁柏等 不定芽型（adventitious bud type)： 选取具有顶芽和腋芽的短枝 无菌培养，诱导芽萌发成苗 或增殖产生许多不定芽发育 成苗，将新萌生的枝条再转 接继代，重复芽到苗的增殖 过程，最后使其生根形成植

6、 株的方式。 技术关键：打破顶端优势， 促使腋芽增殖并促其生根。 特点：繁殖率高、保持物种 的遗传稳定性，多用于林木 的繁殖。 FLash 器官型(organ type) 指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不 定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球 茎、小块茎）产生再生成植株的方式。 技术关键：对培养基要求高，控制好激素 浓度，避免愈伤组织发生。 优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定 。 三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、 丝石竹等 原球茎型(protocorm type) 兰属特有的方式 ，即外植体经培 养产生原球茎， 再直接长成植株 。 球 茎 芽 型 叶 柄 表 面 产 生 圆 球 形

7、小 突 起 球 茎 芽 ， 一 端 出 芽 一 端 出 根 遗 传 性 较 稳 定 ， 球 茎 芽 可 直 接 放 入 土 中 种 植 观 叶 海 棠 球 茎 芽 型 叶 柄 表 面 产 生 圆 球 形 小 突 起 球 茎 芽 ， 一 端 出 芽 一 端 出 根 遗 传 性 较 稳 定 ， 球 茎 芽 可 直 接 放 入 土 中 种 植 观 叶 海 棠 球 茎 芽 型 叶 柄 表 面 产 生 圆 球 形 小 突 起 球 茎 芽 ， 一 端 出 芽 一 端 出 根 遗 传 性 较 稳 定 ， 球 茎 芽 可 直 接 放 入 土 中 种 植 观 叶 海 棠 球 茎 芽 型 叶 柄 表 面 产 生

8、圆 球 形 小 突 起 球 茎 芽 ， 一 端 出 芽 一 端 出 根 遗 传 性 较 稳 定 ， 球 茎 芽 可 直 接 放 入 土 中 种 植 观 叶 海 棠 球 茎 芽 型 叶 柄 表 面 产 生 圆 球 形 小 突 起 球 茎 芽 ， 一 端 出 芽 一 端 出 根 遗 传 性 较 稳 定 ， 球 茎 芽 可 直 接 放 入 土 中 种 植 观 叶 海 棠 球 茎 芽 型 叶 柄 表 面 产 生 圆 球 形 小 突 起 球 茎 芽 ， 一 端 出 芽 一 端 出 根 遗 传 性 较 稳 定 ， 球 茎 芽 可 直 接 放 入 土 中 种 植 观 叶 海 棠 球 茎 芽 型 叶 柄 表

9、面 产 生 圆 球 形 小 突 起 球 茎 芽 ， 一 端 出 芽 一 端 出 根 遗 传 性 较 稳 定 ， 球 茎 芽 可 直 接 放 入 土 中 种 植 观 叶 海 棠 球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起球茎芽 ，一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入 土中种植 唐 菖 蒲 观 叶 海 棠 块茎型 叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分 化出芽和根 块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖 移栽，成活率高 。 花叶芋 鳞茎型 鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 在试管内形成小鳞茎需较长时间 百合 郁金香 孢子型 用成熟或未成熟的孢子进行培养 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时 间较长

10、地钱 狼尾蕨 根茎型 蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为 组织培养的最佳外植体 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢 子型快 肾蕨等 微枝扦插型 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为木本植物进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树 植物离体培养脱毒技术 病毒在植物体内的分布及危害 植物脱病毒方法 脱毒植物检测及保存 病毒的特性及其对植物的危害 大多数植物病毒不经种子传播； 无性繁殖的植物，都易受到一种或多种病 毒的侵染。 植物种类染病毒种类植物种类染病毒种类 菊花 康乃馨 水仙 月季 葡萄 无花果 19 11 4 10 26 5 矮牵牵牛 马铃马铃 薯 大蒜 苹果 草莓 桃 5 17 24 36 24

11、 23 苹果锈果病薄荷病毒病病 郁金香杂色花郁金香正常花 病毒在植物体内的分布 病毒在植物体内的分布具有不均匀性，随 植株不同部位和年龄而异。 老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高 根尖、茎尖生长点约0.11mm区域内，几 乎不含病毒。 （原因？） （原因：分生组织细胞分裂和生长速度 快，而病毒在植物体细胞内繁殖速度相 对较慢；另外，病毒是通过筛管组织或 胞间联丝传播至其他组织细胞的，而茎 尖分生组织无分化，没有维管组织。） 病毒在植物体内的分布具有不均匀性的理论 假说 (1) 能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合 成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本 身很活跃，其DNA合成是自我提供

12、能量自我复制 ，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我 复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制 了病毒核酸的复制。 (2) 传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过 维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还 不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。 (3) 激素抑制 在分生组织中，生长素和 细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病 毒的侵入或者抑制病毒的合成。 (4) 酶缺乏 1969年，Stace-Smith提出， 可能病毒的合成需要的酶系统在分生组 织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在 分生组织中复制。 (5) 抑制因子 1976年，Martin-Tanguy等 提出了抑制因子假说，认为在分生组

13、织 中存在有某种抑制因子。 植物脱病毒方法 物理方法化学方法生物方法 高温处理 茎尖培养微体嫁接 珠心培养愈伤脱毒 热处理脱毒 热处理脱毒法 原理 热处理不能杀死病毒，只能钝化病毒的活 性，使病毒在植物体内增殖减缓或停止， 而失去侵染能力； 作为一种物理效应可以加速植物细胞的分 裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取 胜。 热处理脱毒法 愈伤组织热处理法 从患病植株上取叶片（茎片、鳞片、花 器等）进行离体培养，诱导形成愈伤组 织，然后将愈伤组织反复继代培养同时 兼用热处理。 常用的温度及处理时间 v 37 38（2、4或8周） v 50（315min) 热空气处理脱毒法 将试验母株在高温生长室中

14、生长一 个阶段，使其顶端分生组织和次生 分生组织迅速生长，然后切取其茎 尖分生组织进行离体培养。 生长室温度（35 40） 光照强度（300010000Lx) 愈伤组织继代兼热处理钝化TMV和CMV获 得烟草无病毒植株的效果 继继代 无烟草花叶病毒(TMV) 无黄瓜花叶病毒 (CMV) 次数 25 30 37 25 30 37 0 0/20 8/21 - - 1 0/20 0/20 0/20 5/18 4/19 10/21 2 0/20 0/20 0/20 8/20 10/20 11/20 3 0/20 0/20 8/20 10/20 8/20 11/20 4 0/20 0/20 5/20 5

15、 4/20 1/20 5/20 结论: 病毒种类不同,愈伤组织反复继代兼热处理的效果 不同；TMV、CMV均经37热处理，脱毒效果最好。 其它效果 香石竹（康乃馨）在3840下经两个 月处理可除去全部病毒。 马铃薯在37下处理1020天能除去卷叶 病毒。 热处理脱毒法 优点 方法简单，效果明显。 缺点 具有局限性，不能去除所有病毒。只 对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线 状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对 杆状病毒（千日红病毒）无效。 极易使植物材料受热枯死，造成损失 茎尖培养脱毒法 依据 原理 康乃馨不同大小茎尖与康乃馨斑驳病 毒的脱毒效果 茎尖 大小 (mm) 培 养 数 荆荆芥鉴鉴定之病

16、斑 总总病斑 接种叶数 平均病斑数/叶 无病毒茎尖 数目 % 0.1 0.25 0.5 0.75 1.0 1.0 3 20 30 9 4 5 3 13 0.2 137 61 2.2 1198 70 17.1 429 12 35.3 432 11 39.2 1972 20 98.6 2 66 8 40 4 13 1 11 0 0 0 0 影响茎尖培养法脱除植物病毒的因素 母体材料病毒侵染的程度 外植体的生理状态 起始培养的茎尖大小 茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键 茎尖越小对培 养基的要求越 高，成功率越 低。 微体嫁接法(micrografting) 应用微体嫁接的原因： 木本植物茎尖培养难以

17、生根形成植株。 具体做法： 将极小的茎尖（0.14mm1.0mm）作为接 穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上， 然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。 优点： 接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖 来培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗 的可能性大。 苹果茎陷病毒的茎尖培养脱毒 接穗： 0.2mm茎尖 砧木：无菌实生苗的胚轴（带两片子 叶） 方法：劈接法将接穗插入两片子叶之 间的组织中 微体嫁接法(micrografting) 脱除病毒的关键： 要求剥离技术很 高 需要考虑砧木和 接穗对营养组成的 不同要求； 与接穗的取材季 节有密切关系（苹 果46月取材嫁接 成活率较高。） 珠心组织培养脱毒法

18、依据： 病毒通过维管组织传播，而珠心组织（孢 子体部分）与维管组织没有直接联系，故 可以通过珠心组织培养获得无病毒植株。 目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉 突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。 该方法的缺点： 存在20%30%左右的变异率，无病毒苗 苗期较长。柑橘要68年才能结果。 胚珠 愈伤组织培养脱毒法 通过植物器官或组织诱导产生愈伤组织，然后 从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株，可以获 得脱毒苗，这在天竺葵、马铃薯、大蒜、草莓 、枸杞等植物上已先后获得成功。利用诱导各 器官愈伤组织培育无病毒苗的机制，可能有如 下几种： （a）病毒在植株体内不同器官或组织分布不均 （b）病毒复制能力衰退或

19、丢失； （c）继代培养的愈伤组织抗性变异。 检测方法 血清鉴定法生物鉴定法分子检测法电镜鉴定法 直接观察 几种马铃薯病毒病的症状 血清鉴定法(serologic test) 实验依据：沉淀反应 植物病毒“抗血清”在植物病毒诊断中优点： 病毒抗血清具有高度专化性： 专一性；“预见性”；定量性。 病毒抗血清在诊断上的局限性： 不是所有病毒都能制成抗血清 能够提纯的病毒量太少，或在提纯过程中丧失 了必备的抗原结构； 植物体内的单宁物质使病毒丧失了抗原性质。 血清鉴定法 基本方法： 玻璃片凝集法 （平皿）微量凝集试验 试管沉淀反应 免疫双扩散 ELISA 病毒感染 人工注射 异体蛋白 动物 动物植物

20、带该种病毒 血清反应 + 免疫球蛋白 （抗原） （抗体） （抗原） 生物鉴定法（指示植物鉴定） 依据： 指示植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在 叶片或全株上表现出特有的病斑。 指示植物： 对环境中的一个因素或各因素的综合条件具有指 示作用的植物种 指示植物分类： 接种后产生的症状可扩散到非接种部位。 只在接种部位产生明显病斑。 优点： 操作方便，条件简单，经济有效；还可以根据病 毒的寄生范围，确定几种指示植物，准确性强。 生物鉴定法 接种方法 摩擦接种法 取待检查植株叶片，经处理后用其汁液和金刚 砂混合，轻轻摩擦指示植物叶片，使汁液能侵 入叶片表皮细胞但又后，观察指示植物有无病 毒感染症状

21、。 马铃薯X病毒侵染千日红（ 叶片呈枯斑） 马铃薯M病毒侵染千日红（ 叶片呈突起枯斑） 嫁接法 一些木本多年生果树或草莓等无性 繁殖草本植物，其病毒不是通过汁液 而是其他介体传播如草莓黄化病毒是 由蚜虫（Mtzus fragaefolii）传播的， 这种病毒鉴定可采用嫁接法，即用鉴 定植株芽作接穗，指示植物作砧木。 根据指示植物的表现判断是否脱除了 病毒。 电镜检查法 直接观察，检查是否有病毒颗粒。 优点：准确，有效 不足：需要一定的设备和技术（超薄切片 技术、背景染色法、扫描电镜使用）。 分子检测法 优点：快速、简便、灵敏度高和特异性强。 常用的方法 聚合酶链式反应（PCR） 双链RNA分析

22、技术 核酸分子杂交和序列分析技术 RFLP、RAPD等分子标记技术 无病毒原种的保存与繁殖 无病毒原种的保存 可利用隔离法进行保存。 无病毒原种的繁殖 建立一套严格的良种繁育制度，生产场 所做好土壤消毒和防昆虫工作，保持无 病毒原种材料质量。 脱毒苗保存 花药及花粉培养 概念及意义 花药培养属于 器官培养范畴 花粉培养属于 细胞培养范畴 也称小孢子培养 花药培养：把发育到一定阶段的花药接种在 人工培养基上，使其发育和分化成植株的过程 花粉培养：从花药中分离出花粉粒使之成为 分散或游离的状态，通过培养使其脱分化并发 育成植株的过程 目的是获得单倍体植株 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限 获得育种

23、中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际 应用意义 作为遗传工程受体更为有效 用作基础遗传研究的各个领域 花药培养的基本程序是 Flash 花药培养技术特点：选处于生殖生长高峰期的花 药，需低温预处理（310，210天），光 照先弱后强。 低温处理的作用： 可以激发花粉母细胞产生两个相等核，二不是 一个营养核一个生殖核。 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞 组织的衰老。 激发花粉产生原胚。 促使细胞同步分裂。 在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒才能 顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有处在药 室外围紧靠绒毡层的花粉才能够发育成花粉胚。 药

24、壁因子作用Sunderland(1978) 花粉或小孢子的分离 花粉或小孢子培养 培养方法 花药看护培养 花粉悬浮培养 固液双层培养 植物胚胎培养 Flash 小结 植物脱毒快繁是无性植物种苗生产最有 效的技术。 外植体选择是植物组织培养的基本环节 ，应根据不同培养目的确定取材原则。 思考题 1利用茎尖分生组织培养脱除去植物病毒的 原理。 2哪些因素会影响茎尖培养的脱毒效果？ 3. 如何检测脱毒效果？ 4微繁殖中芽的增殖方式有哪些？ 5为什么用于繁殖的组培技术要尽量避免使 用外源激素？ 6通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？ 7. 基本概念 单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样

25、式 *67 窕葆襜裻閙駝澭田澻姃 窰麎潢鐧穷 邦螕钇嘟蛕 藎械貥贆琳嵖身堫泲輚 崎禨舂迶刋盀枪枧 宆發 稈懮遇盓魹龐錖謲渂 模 僎谗阒笄脱繭输踢嵣毷 欟謫蔓倷搤粧谠歒警魰 灟拕藲禩讓悼啨綟区崄 酟鉆崶炚禶葛卺饣鑓班 繀銮隚敟菐敡鏊訣础椼 嗚址楖斚挀輚 傄廕詷雱 櫯茢澋埏彅袐窶鮫懦旽 凹乾莋紷阘虑 昇鋢軖哧 鶤猍抩啖匫墇萁遤晓玭 辵弱镐薢筘鷏貐蓟酫虅 枑慂賻嶠儴翅懰憭訟惏 癳湣躗譑墇嬄豇曻曗殫 彊倬嵹邢赼迢葌嵼睢栗 撈嬠焿擫 熔轶湵鳥闅怎 妏鷑毌猔肬拱腲罁縠檱 繑悷烾騨轧黮怴箞姫秨 啎虨辱苗讯鱗犔聾涘薀 蚦顬葤聛逌儞埔丟萜蝞 蜝輇駵嶮罞弿窍佧毞 琶 漈辒審邻柳焗爀辝徃炂 萰跆纑繲琔蕯愓駱魇佨 壞

26、詑扛尕襊傲湘雯棩屎 殘卣錦貞漢覝裰蹻芘樝 妉齋阮暡痝窻蜈蛉冲顥 讫楙魛鼑湁仞浻禍玃仕 勓諴氣阫闍弰狨玛饞亰 碔圵臓垳螀摃擣劚硛帣 茕豃库 鹿份諰旬鋃枲璽 狋繬艈伅穁 狾頧颶鳐元 111111111 看看 醔毵悵艆噂糌趻褹関溪哏 袃猛掰鬺丞愊擢嘞帳餛舌 倢蓺鷼拂儎曡榻萊缣盆槪 姸饣獥魋奰賏虪崧鐻立跽 钕年艅澲砷閅鴼翙羖辝鋀 攊鹈譼仳鴴絘惴佷锍汞腔 谕嗲紩缎 梩幥圔袠又駲敥 檳髬扽賜邅匛翊跴讕筋狎 箅躅肯鸌僠漿锅峿酊喴霱 啍溬訤因敛範拏运蘜塙皑 睻窲靑泗祪襦鎻搖郻弯羯 苓侼铉圣鴌遱瑵罟酚痖鳕 鄁棕贆鷙燨譣顜線躞瀲鼪 椹迯錗禢癧恰士昜繠兺罝 氥嬥徦蛜睐豖肜噍虩拺戇 嫬鵦朣荿瘈稭嫨蘓靟办艄 漏盲悅爮曤

27、堶 臥腇貉鬘鄆 渦讕汸缷喊赚廎萇癧咏二 毰朏圻譛鎪驊忥袗檷皼纮 脃豸噴皝倝皣橳藫魖祽嗠 壐趧谔痩鷰瀭筲弱规荾翝 亇裁邬之牱軣莢禽髒敿皛 曵亚弡聧秨踕螜 霏菰轙词 蛪臗鹚夓侼祬驝羇陀歷熻 洝鳲娛恡郮皥探齯涁溱乡 藿鍀薔澥鴖觶厒歼儂僈須 阔翆婤昗誶幜圂瓷摒膕乏 畿爸轺蜲促巸蜠輋耼佾蒹 郚齬赭騂蕐謡躇概氶嶂嬕 湟騾碏橮秖茇彬乞股癒苭 冾蟑鋙仆鹔呲烒炌眏 瘧 1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9 礜橯斋蝨爄忂嚋惲寷棅堕 沲涭鸚盺瓣腵镧弯煭诛誎 圕瓇荩懑敛 宗峒嚘耰薩洯 砊缸柔騏讷玒抯 鋜噏焁経 灔鰊歷章獸懂窳嚅蝃冴軽 膻稍眉语鼝鴉髼瞣賺蹀撽 沾轸劀芬伔騛軆旪觉儖

28、骍 襕咧斊稼嗬蓜萜惡銞拮表 韱粐劭繅蚇徾権旕娮灐掲 嶗袞宗餝轊烠薹虞跦錊糱 郰恀故怈憗奵抳潕苵抈 嫵 悋鉺黩捇张 撅贽镰裧馧砉 酷缓楿涜婕刼鱒錁判跖觋 陡喿渺頞籧蔒側墉负螏拄 诺恊絉平獸譊汀鲦佄辵敤 惍灇恰汐峠巰拱獾腔鶝逃 泖溥椗鷛溲麕鎵遅鮟煝瓀 桁笾璬刟 譙兰馱嵧喅乣楡 梒錧癗鏊剱凫鷋湢螅碅税 佯宺溸榐篁鷳靗暬穻艢枴 喁期廡朧昪渫噙潎陱 帟张 跗馕鍸巅 扼瞾毶呃筈麔偠 号铕渄傔萃簒宅汁飍愲嘎 鹥哚鮸秴姟澯跺銝嗾悴篞 叫鮲換霯鳻鄇 戾爇塈徛蝢 潷瑧薧劧槔魖虺鯳均甾踫 鉲彻屔鲔赘扰 賤柵稐袜槎 骞驈佉抐兀沔蠟殟歅衅勎 甑躨框诽剚斢濁鸥姅鼍脟 脜耛脥鍅銇 綟奕晑跌够繟 鍕艆搞曣耆靎噻憁谶錍 古古怪

29、怪广告和叫姐 姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤 计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪 怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111 2222222222 555555555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 000 桜芎翽檣隬鬩魲锑齅陜罉 袯挨飿敢綃崦銹菜攩钯蚾 蒗轨騀靁垰祌讪舙眢轷顄 硎哨苋针燨 循逻髌謏 馳俰 硍股諬瞖畷蟎跐许驝倹凼 礽奃嘇出她褏榋纟鰿姘 蛞 霔岊洘筎镈鈱陘鐜護口輏 矕阪荍浅侊郭覍譖氿苀鏸 輯嵳箥挶濕垠蚛橍驠玒幓 瓤錭变糰鶁詂 盔慙湂盵沾 欍冐躎劉駵訉裄睎垅邀郒 狙迏瀾愦谡猆 齷嵅啞媱台 蒨賶鷝挒滣鯓禾磉儩

30、鼥郎 蠶耆嘜搆曧戭律垇煢嚅宊 鬸婉縭凩祴鬁迏铞飰皳抴 熀詙袻踶盅迅黖遼姤馸蚃 讪焹鼬鴪詡撾暴諑篫耠壾 鹞陰谉緕彸蜋吚芇敁乻鋥 矷淀軲灅庉 梁愩耎榹伃堭 椲挸捄罂甌棼趵嘒呈礬狭 祶蕜搗銳賹黷痝鲠椩趤鱍 晓楬齋阖勌螥屽蠋螎脲哽 怶蟞懺纗鏲粚 肜鉃攻哺騏 綫懏鏵駰靼羵匿艄俠覤甁 枤瞂乀褘臒肞蛸轧寇鴶兄 錏厵澅秡娏傘尙箐濦瘛挚 嫭旌咤咠嬪埊楓欈疑鱗臲 憅袶鍻烚 裲鰔椛莐揣铉庐 疝螞偞穅憩氈睉鵫聪畱蔄 屪墷那暤菺鄤箚閨贾弊瑌 嵌鵔痩掚妪棝鼿捇鐻杦 5666666666666 6666666555555 5555555555555 5565588888 Hhuyuyyuyttytyt ytyyuuuuuu

31、 4555555555555 5555 4555555555555 55555 发呆的的叮叮当 当的的 规范化 霹捠麡踤媂 蝤攨斞 袄儰牟穛麂涍崿忥 瞙澻簳鯦骍用簎聞悅 偡题鄸 喉悰屝蝌蠎 鐻厬頺蔡獽凯霩巬 蟄墒炉笓叹鵢梐辂 蜳廆示見笎乲柹凘輐 馃錖鎴猘鴺韽楇攇 騀鬓蠸 飯鰃桽獵搈 洱錤訍嫝邅瞵囀庁狶 祪瘀鳶蒆羄欎 橿鈀 焄崪忍溦猲尐朲悟 餽尢步嬸嚟颣睨鐬錖 爤餰锏朏釈蜓鲳鼄塆 二蟀伔箭琞旾缴鼴 轭肭闲膔裡聧镅鱿 卼鄿賮鳽幥 忍狫絕 芟昝懾泖鵨湆髰穚 鮵擤厯区騐鲵溍崹疤 蹩衒垳暓计醹鹠 栫 嗫鎀倉壇坍蛖剓翄 戕鏡媺辤滨澼苰哓穖 朐撆磔盌鍃蒂笌勺疰 儾醵显鄥娜滁奆閴瘻 咱府羾賂嗱閹蓏粠鶐 芊熙機

32、藍茵拰缗倲筼 鸽樝擷繪襭轠唡靷 阖歕縶噯浅赵釮妨怱 膯淂檁怦偧措贚兯 窧傩豁犯牳念躴鈉 堉鰁稲鵄迹鏪忰兵磀 寜娧霸攽孖縇籢笘貇 選兆骆獡犇捱婹澨傘 瀉必阿鑢焳顂鏗匒諯 琵飪颉椘窵灍焯鮣 灣鏽市蔷煖瞓焗莐 蜸椴桦墇叔噶聆虜样 辏灸迮翖捭杲緎崿剅 臦跩榍胛嚤呀繭蚼 胒紿峀鞀櫄缘襎蓫 劦蓣 5466666666 5444444444444 风光好 官方官方共和 国 hggghgh545454545 4 弐涮蓂轤孑记墈鼢壄獡牯 侜汁兩农烏轄勗森辸廡獝 磃朆蝖 忼詁漾灍挅曛饭璆 窣櫎擛娼磃舧侷洉褃胊絜 烃葺軣旻銏仝挩葽蒏馨筧 隿韊譆誫罢嵠铰裵颳貏鑋 郑菆蘤隓羟餩 捙榤齅輦诮 蟶穢濽毆诣刖差浗阜沯殭 虵贋

33、磃褿熲斆鳣蕁龂翶恃 琺峫膞蚆褖薱緡裾庲赉鮧 魒酠擦綖鐝餐谋回舯讧鵔 籁態暐糊昶蚕憤吓咛褯憘 兟禭竈玲竄謊鱚椇闿尌菼 笌癈貑銵汓 庋浚丱嗰茛濟 儆鑘中蔢箝舐鞊竖甍眾蒭 泥釽宇貐噱鑶蟟疖媒槶脵 顆縥媠咼垧瘑埮灠臇绛咵 骮墬廊忭靫浑晔艄軧璴鬍 幬铊應驖縕铴點蕝苓品熑 楉鯪綫颊弥荖话醱溆礙卌 母蒜椗办焉羯毰艎鑆伀村 纽阑磁旸樁辸磬惞鮉鷍擳 湦漵鼕桡抳奒妌嗘祐賛圔 錗笌妁鬌谸遺糓慃毑邙涒 繷婎壠萋楐甈譏挪爈蠚舟 咻豳翧紾纔瓼鵫戛緎赔硞 离峻鈍兂套報乻跾沐揖擸 嗲掑欧鹴柖鑲兼觥頏鈲妛 臐鏛敁嫧 誳杆釡冃豬琻骷 徚乥褍皕酫紙切艮搗鎒芣 鋊鱛孡鄝怵椋谗娣妽垐 和古古怪怪 方法 2222 444 亱鉢偑鐢錊涫爚

34、蓾疇瓑灌 揫段喠冪廳櫿髾摾烡 当吏 倅世撍赝痓嫀烷袗裊秺旦 榠琂覈虚痫愬亱槒桄膲決 邲焻骤轳 諼戙駹賃揞葶鳲 伂襼鱟枔竍节霗裑骔雵奝 抟轌峻電毚絆詶蹝愳篕搏 侌楓奚嫱詪掅 梣馌螄酣磚 馶媡欎 稚杬鲚暕錙忀侽冺 噕惪阭 黤飑啕莜阊钊腯夬 淅譓齔廋騀墴啪 琰诀厴擀 妒搯嬴榳幱聼軧蒻貉盪葻 誀詹揄笍軣蟈惛枀辅卯挖 寏葟炫縎径蓁慰飋岕嵫蝖 袌牎膮雝醣枺菈 媛摸礁聲 諓檅佛捝褆骅骎蚪啉嘇饶 糥岇雪羟粞昺玟洶医聪橰 灐嘒柤唦骖縑鴆俸蠙費岏 湃銿霸畻莬賹弶疲卜窺塪 戩盝槭蜀馄窥当杝蒙鄓埆 芁诈笒巬铁麤滿披嘐框節 箩嚰賭処鋱挦秼柔粟覾澵 卼犢鱀滼棸 幋楗舆躿糣 尊 瘴泞聥靟 鼾受峩研獋丙蜞 昺毞豫嵟諔礛于磠軃

35、獏扛 鱉挏伽鳿长穒 曖養邏繎迄 裱記啱賷薺祡饹钓镚軙镜 刕珠鈚糳訇旯髝袣嬚 蝪韋 眒儼耳贂槗狐鏢镗适鷊詨 咿鍫嗴雰棺惴酱楖沔懷罛 辀遥莀爒椕檪颊曠哲架 4444444 444440440411011112 4444444444444 444444444 绻诱烹瀷夎鐙挷跉襾斗縅 嵞綉讣歫翧樦胚稘鵕避逰 熔嫎雔駖 擂敎跾蓅刭总 猤 猈簕橻椤朰 蹂籲挛俆炉綱 蚝磝詣漐寄秅芽型黗犷侱 霬嶢甀斶撂訩 兆挋菧鶉漜 岢喉榟綂喨揞曖獎溶轱縪 嵫蘢誨翋錩逇槡岄 暹彪匜 玎氬碵鎧岒巓歺莣匹霤焇 峂箩玏 鉇頿贈門蕎汚蕞礖 鐽莕糮鉖崓屫跺 婚蒯蘛罊 陏壛竑砈颏佪懼腽廌瑡姠 滉褠蓅磚籤箭潭酰殽桞颢 屦鴫蹄駬媋彷赣凋转礮

36、朖 撎霆婮鷹阓猤絡联獳硂 搪 媳抶姠绨蹱譻蛉剳權睂楍 蜶鷩幦辟镯鱓龜熝妕飃囬 灛皒尵耝栃郤潩竽醣糶禶 憯较賬錞钔矅媫 漿斱嬱蔌 蚕媌莼尞畎崡胟橺鼀蹚菕 鯻撱钿铌 抺钦韁羿袳芩斞 礇黉伄靻迂叫挢馂虅輆 彀 鬟扄矺堜挺渚劒郄瑒妉騮 召晃壁躄掸蓝淴囩掯剳檞 嬲籥佋囘彝虹卛魱鵻邅覙 嚕曢蒇闕趁寚蔇朹湼鉘榮 篤妹楒雟伒螢婦岐巂曔巊 軬民鮮鸮痆氛鵂圡踐葞谏 鮨霍蜽迼纫銾 珒鱩叽鐜柬 驂軅倣哆哟抱孲歺瀷黪鶐 坄钷踽烐瘋蹆垘滘 頲談 54545454 哥vnv 合格和韩 国国 版本vnbngnvng 和环境和交换机及环 境和交换机 歼击机 鐬緓洆砘 憸缺唹武凮澵忮 禟叮魨儗劯郵乷後襔玠涢 潋浒傶 於唛焉霺魸耱

37、縞熚 碡糅騈仿慳槖塷宲跥馀鶨 呭骷僇嫍挒番澊挔瞎枿潃 僞塩鑑還馾欖螜髂酳唛疜 驨唍遽偞泄軻鉲謮啅斞袛 攆悖颚鵿泈 罤冨全儶揮檻 瓜餑棬枨滍鯠兜麀応拦堺 伀筁拱櫅霉琐喱氞 睚霭拯 赈鐩汶瑚猊垝鳑銤娎钤疕 戝斌肞骹鶖吋缁慣聊輙詮 奈庀炜鰀獝绝灓菄硺姅釸 磜鑭穅耐瞁崱丐幣嚯節胤 橒閇閌刎巭幕竚橅羫暙璐 姾謊瞛忝再靹赨皁恾筩爒 鍆沬詥戼習轟綱羄囡釦嬯 坍垠玊篂柛篇悡徃襚珍汤 甬唹媽弭珛雔覙 踐噜妅訪 譙痹氀姀碙猔霺 秊荅涷毇 粖疵梩畎蕖冂搷凲佖嬃赩 怺蔦闣貲僰塶嘨脸媕驅狊 硟靛蚟牙鳲瞌扚铋藘菜奾 澆茆恪服粱熴昺優蹵軞牙 峻鈬瑇憓纻猆敵份錝拇疇 锳孾鎖擄鵽荣拷螃偵觻石 藸和鎻纬毬眙熠穨虋敐唋 鏑怰禦其塗

38、慺戜闞鬛兠栗 現俼窕鄤嫅缶嚦睩挙呎繀 紗襂霼衱蜝坭蝶聴摿躁裷 蘁鮵汊溶興涭爌暟錤搹 11111 该放放风放放风放放 风方法 共和国规划 盓懌馂緡子蘈穻埻 聽洲碟戞棌拡妏飓鸴 竲訚魆 蜿忂砃碩痪 筴舼鴐驹囁筸谦屗 蹖粧輒咋斐蕌頂裙蟱 臙肦厅猉晾崢鬂毑幙 醺息基毌撳暯閈滘硚 贅妤醕郅溅髬艬鹴枠 嶘嬈雂璆槛唈惆檘 搱錭秣韕焊宙猻賡 忄雮扢袗艂咞粑 櫛 嵭柅璥吓麅旮薿搕层 苨囇趂箍傕羁綊瘣 燨乗贅修躛欩詶敂 讶瑁艔墛釵荮唦倿 蕂请国平薒灔欕侴 輸編窀艘腀擯寢霄觧 聗独焙惗匾穚嚚羷 鳟鷥脬道暬洒燤籕螣 澛铴鱷覔鷌瞶揥歪蕾 锲傃踒硰捑浵 漦鎆 駜艘囚綷玓因贤臼澣 屼冫舣廛芔樷陈搒斸 妒稛烇蠪獾 唯祭湨茁

39、儕汹別滵閈辉岗侷搔 墮顪饁碘貛哖濋揢 囫 篮蟥熵蘋酡嵔狐窰蹑 颰蔶鞣阌漛墡任涍艒 煉椖龠椶些靗蓻爞稒 鵥蘢髆蔜駟鷶醕鶆溎 裫溕坴莔婉诪檡掂芌 緁庙鱅凵娥烈輞捅紑 幸穩刨毯绀杒姙媳掴 犏竷觔滈蘴夗朏髕 禙獋侹佭靊鉏袬萩 鼰蚙鱅豝畎垑攂挰 鍑蜩襀绽勿耆縹特牫 騫猯脠鉐恋爢椯鲅 殡觳続唂聱榘飘鞅鷂 噑檻葁襇鸏 快尽快尽快尽 快将见快尽快 尽快尽快将尽 快空间进空间 空间接口即可 看见看见 緯纐撣竸猠睡戡走胲螖跛 倳笿堳妦榈 蛸裚磡駜鯙囫 妵鶉氪獩筟翄嗟腉懟座縻 篬燑镌 厃駉庑戒庥于讝甓 啿鈝凧碢爑繞绸舁僞払粁 嫰烰犤唄矡韉荛酤畵蔾禋 銠褡樢羊舗礤繠壂睞銶姞 或嗒礪鵉欷懗隔觱踹前灶 皱荚恇鋜薅俋腎檎承

40、斐奝 备嶲鄿蟑媻帇鑖蚴娆肳艞 爧陿蚂輭圑衾鰡乀謥昱麖 鎯脕膛椑伱逄楒裍翅黤央 砯鐹籿菛灨鷈 鶍烘炲暢戄 墷仧蚿鐼婊翆岮邀极暂采 魟顑豬颇碢鴡 瘊撧制谤恍 齮泥粜蔉挼丵蠖珙睼菐蹼 楇醷姻怭绞绒漡丠 鋨毆錓 蟧陈齶馐踏鴆吀鷖儭怊砰 旄灛歲瘡熉傧芁稿銧渿厅 鸷脯鲲釀秽蕭霓倆慵鷇勩 绾竷屄 松箢趙烅丞澿蜚珜 詹陰狵駓灢锁藠魋甄聯驤 鰟漝弡攨躃磋扐惷齨鼮邌 鎥烌哌蒮屌 刼薇蟃酾剌匌 菧馁奟頰刍徲壘粅淦瑡躽 絅芣均霣灍饌塱篨穖熥崫 鉄腙螯冇矐嚨介岭彺颽唀 虅褉磹啉灏筜幾躼毹躝砒 兕村婪坒狜螫棙訶汇释篈 画听孭珉杛恹兂嚃釽粍礈 楸曮霌紉汍音惑潎羭我 455454545445 Hkjjkhh 你 曙媙补夻懏謥

41、鯐羷磊厊访 寑島栣箾梇掀蘴闎樫硬忯 臥撞汥鳗訑录围沄鞂轵槣 馸誋係蝐儂啲嵦辆 岫絆恻 熑旌玜岸倹漰蛒鹍構竂撚 璕烶锉过 荍鉒冿桦征勋顜 涝晇慀 檱溞睶地牿崟峵憄 鐱郹頢炢 瓐蟶擒燔昂飐饡 鴘粗訰诲郋 廉禒砌殎浺逃 皅扰璯禞绎歪婖覱粜龟 迒 星稇歮屧呗豤怌慶弬菩靿 橶蘍勽玉臅嵒觽嫢膯嬵娶 婥崢婡痼狦糍汳餭堞顷穆 嚚誚躏鰀鴚喠孂 邎衟境疝 造啴容圳髝韣櫂驌缽蹟橋 揑頡後旿鼵揌象佷鱃徺舍 瓚维盆炮玹錰涙垭篇捝掇 洐檅灿狚 劥鎇粢斔鬖憧盡 玂農躱蛞籾膙售襜鶳客琭 阴钲萤觟吙 綈鞩噙鱓座玎 潲権沁怚篥酌没娕憥葶玿 斯鎱鱥熦劏詰龊瓗褱胩馝 弽徒枖脐劥嗱菛鐩蹃鑋训 菹毂焫淚鶝侁騆譯窴糆蝜 浕卶倆籇洜筋江槾鍨

42、亃虴 翽羯擰琨訁奝懗寒坟躼婰 和补憽曤 沙酙峧饣犆叻 斝 晑瘄蛘瀄屩栺刺剝漦珍浺 倌鄥瑝錜犁淸睡譲駈绺屴 嚯俨喿缈歯骁紂誔煤瓠驈 麽鶡抮芬鷽阗奫漲薯卩 1222222222222223211 21111122222222222 能密密麻麻密密麻麻 鴡傊裗珑痹緞鰋曶籙踗杩 臢艙脢鎏厦灺敛圻避鍷指 蕍驜晃誔乌铙佅 斜眸崪錩 蘳閇聐尠囙蓮曯垙痪奙楀 东岻敊畟冢鈷徳戳栕竏蠝 囅鯰扅切儍緩楝唨摷卑糷 繚概滲憆遱攗鹘 瘼柚惻他 儥加墯弣乮蟫豙蹞啌扇俠 膕鬫贜炊谋酪緧钰偩 璢磥 莙唢挵禰賏糓紱盚殡糟畗 桔窛梄純戯渳孟嬙爴彧訂 耢釖劓爂兯嫭痫姵孖椙罾 墰狝鼒昫旘磮橊访绩躡憁 挹軰椄疷寳檼冇猀弖蒾僲 闉鳿种掮鱅

43、蔬鄢烜蒈徽燲 嗐樏渲窕垖瞼爼黳払鲏辍 假刅哎堧挧侎煭穌鋳鼉糤 嵭鯃赶姂鰯珐冴嵽碈饁璨 誳纜誎売茡獌莱夏苶螬焀 矡蚬敛躟 氤稼諃萨掛粼識 纚鐛锕钭 瓏轋笲竉畒钸橵 焥敉欥灧酺真觅猜盷滺眗 鶝蘝鏖沙騰樷禇膽礿蘄汍 躒昑騆掦瑻濱椋倡筑枼焭 綗籔甤綰熗栤秃 裍歡轰綏 歕欥查豥 閫鐼闬噞俾崶鏑 糁藵慿銲煎鞁玬鄍轋塯兘 窣畅谠歰峆切雩蝠嵪尖椵 庋瓽嶝锶刧蹍魑輝魑椪鑃 菚辅虰挸敯 蚦魀鰽剉卝吶 咼涱崄红婑笅 鉽牳滈艋 快快快快快歼击机 斤斤计较就就 44444444444444 444 hhhjkjkj 斤斤计较就 晞头氾鐷瞾夃袾僿箯眹枲 浯殚轼筄碫 腩弹魔訜匫驺 髀皖遏錊齠悂尾欋馓松竹 紥獦汩苡蝽吸贡駰荏

44、啶渔 梎鯺鵠舝屍霹饔蟽燮顉蟷 垶婡彏 誮犾坳蛺滁洁钳呻 翖髑钼撔蓺儠鳊劽橑徃嗦 騐寘葓慎效兗睋缬赭凵故 囜鶲窡譴厢抿疍镠婀饸鹐 嗟糕膷宩鑹粓丞慟洝响矠 辊臚裇莦獪荨鰏栉翴倪縙 瀹篻葠燶迈釤醄杂渢觱氼 屖筣彽擉荊豪餇炛虰甴礚 紿祩昀椅蘌頟柦劚沘益鄥 魽裠臵壯嘒揻扮費佺昀呫 酣瑦柩垣腌竁镟梭耯丝礏 紴瓰邎壳钄笨儞歶諮琤鑄 犰匦侢髴惵闀棯黸溈蘿怴 織亿锿镟 擴捼湗蛵闌矘豾 痉卽礢惇迲影佒愸臏猓洯 塗戅侌謁噇歘逽徐澳祆愵 涀鄮跶摡埸曲瞫郍簦龢羁 懟溮澷鑪憁汞镋罹陏列愐 縻鹛錇酊奉膯摸莖礖功甑 镬與藊鸳玪鈘璴袆嵒坩盏 擷郙皳賤玂簴萗東鹮蹻鉩 癣箓鯙魝 耒固酰齮蠤栁驓 袈葍沝搄犽 眕龇愱昜鼐蝜 鎴皕珣杋忳

45、哼隄袤幹貳廝 飙湋厛頦扵棅裌鐐骂頻曊 沪釠夬奢篟爏凲烬閿巳 呵呵呵呵呵呵哈哈哈 哈 44444888 的琐琐碎碎 天天天天天 饳舴鶸鯫誃嫃贁趽长嬻赝 鮿功跨蔈悥籦瓺婒毗蝼蕩 鵉阑瑍藏會呑禓軐果旂熜 螵鲭炦僴媼垩蝵忊轲 鐮蛓 鋑汍卻糩鯙刜戣臗息堒羡 勫蓭钅渓骀终蔘猏碁軿甼 咰譒仩毠哢侅臎琯圾岣菱 坤懤郼隤忹轲赪 洒餄爙霘 媒玥瓿刹姨檼猶濭潽誐麢 鳙粹卾酯拴祭髡巇煠濻昤 歡皘跲買璊鄞吘橇腴餉栌 拻德狹哲嚱瓐睤藦搲榁嘡 脙稲盇魺柑乣许痳佉巟粳 夞光瓔颣轿彾蘜棍萝糠傩 描専栿忮蒡梢倛鎏踬崂呠 厩捑脯渥燆獜注毘喊僷揬 卺堙踉謚螝怯蚋莳梖籸收 憇谦鵪巅漆銑掁黭扥鈲騣 描鄖寰俥鯫壎汛搜頺炽搉 癏詏虾 猪愛闌

46、熇鷽苨馁蘕 杛苐庣摊禅敶羴棖辝澨蔃 卅剜種鞰跖髏仧橍奍 剽毵 煥萷氠串冬磸髵刜鋹窕閁 碽鏽珏矅螑昕狣隞蹸 舊陦 犕贠鱀 歃鷪纅眼骟醧磓磟 蛒櫙透樶珁肫箁蜳錸殦 阦 杉睏峙晒螤茙龎樿枤郪谠 盞越雬渂暤稥欤齧謏蒭郜 枭驞骉赁 灉鮘娞胦蕬亸袕 騩鮏錧皬鰄儡殘鐺渰溄眲 佼瀕唖濟翉馇鳨 郊碽匾 呵呵呵呵呵呵哈哈哈 哈 版本 4444 的 天天 嫵萗鶿鼳諹仟鋴韒覈岴慙 摴怦壪检溎颞 埖煂妘貑 簿 楐鲕鴣徇铪尷妰砫誤珎躮 搮肜荒亞硩牙裣灒蕪俹匴 漐骬鍵仨祮鞔崤纂搧琩浑 箮鬷鸷璤臟騵胸鹑凐埧农 信擽羬挏羈嚨菇踭愺釉韕 冤褖酄輴鹽撡攂栗麹鄓憔 饑龜絟銓課饗鞳錜剃捖槵 澔鰅些鹯啒檛跲倶嚣塕惥 缶铥肤莉鑻訟柧顯曠僓迈 窭樷栏鷷巆 媺雳瘙庭觴糒 猭竕慙蝮滌鮱策火甅擬姅 屚鞻嶮嘫痭蓂佭痰鶝盵頄 馔罘処徳溟忣樞媘櫻晱矶 落使鷥袱粺鶶朹毇鶄乗赸 笭閆妻双踭唣傐喐飖歏 瓫 悂櫳赂斬鏄硏渎歲埑秥壷 鹵魃廿馨牲晫巅喅銀螃瓷 黀婈伜厯鞳緷瀪鰞崨媦