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1、掌握无菌操作技术。 了解小鼠解剖操作技术。 了解原代细胞培养的一般方法与步骤。 了解培养细胞的消化分散。 了解细胞计数方法。 了解倒置显微镜的使用。,实验目的和要求：,实验原理：,原代细胞培养 是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。,实验内容：,动物的选择： 选择大约一半足孕时间的胚胎，1013天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。 每组小鼠胚胎2-5个,实验材料：,每组的超净台中有以下物品： 1. 50ml 配制好的RPMI16
2、40培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶 2. 100ml灭菌烧杯2个； 3、50ml离心筒2个 4、灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个 4、1ml ，200l移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个 5、细胞计数板1块； 6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把； 7、酒精灯1台；,试验操作步骤：,1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠) a采用认可的方案处死啮齿动物。 b立即在无菌超净台内用70乙醇擦洗整个动物。 c用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有
3、胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。 f漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。,仔细清洗小鼠腹部,2)将12个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。 3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。 4)在温暖的环境中或置于37 C培养箱中轻轻摇动15分钟。 5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小
4、牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。,6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。 7)离心混合的细胞悬液，1200rrain，5分钟，弃上清。 8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。 9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。 10)用含有10牛血清和抗生素(如青霉素、链霉素)的DMEM(GIBCOBRL)lOml再悬沉淀，并使终体积为20ml。 11)让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。 12)为确定现有细胞浓度，加入0.2ml细胞悬液于1.8ml
5、1醋酸溶液中以裂解红细胞，用血细胞计数器进行细胞计数。（细胞记数方法见传代培养课件） 13)按每细胞瓶I x 106细胞的数量接种于10ml组织培养液中，在饱和湿度的37 C02培养箱中孵育直至细胞铺满。 14）24小时后即可观察 。,细胞记数,1.按上述方法，用胰蛋白酶处理细胞，细胞重悬于细胞培养液中。 2.用沾有70%酒精的棉球擦净细胞计数板和盖玻片，盖玻片放好在细胞计数板上。 3.用移液器吸取细胞标本10l，加入10l台盼氏兰溶液混匀，吸取10l混合液从盖玻片的一侧将混合液打入盖玻片与计数板之间。 4.在显微镜下，计数或细胞。 5.计数细胞计数板每一小室中，上下左右角和中间的大方格中（5个格）的细胞数。,6.在取一细胞样品，同上在细胞板的另一小室计细胞数。 7.合计10个大方格中的细胞。算出110-3ml的细胞数。（每个大方格1 10-4ml 10个大方格10-3ml溶剂）细胞总数乘以1000即得每毫升计数细胞悬液的细胞数。 8.计数完毕，用双蒸水清洗细胞计数板和盖玻片。用擦净纸擦干。,每毫升细胞总数 = (A1+B1+C1+D1+E1)+(A2+B2+C2+D2+E2),观察培养情况,预祝你马到成功！,