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1、实验目的,掌握用差速离心法分离动物细胞核及线粒体的技术. 掌握分级分离细胞核与线粒体的纯度检测方法 学习线粒体活性染色技术, 观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布 了解密度梯度离心法纯化线粒体的方法.,实验原理,制备线粒体及细胞核采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法 悬浮介质通常采用一定pH的缓冲蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性. 詹纳斯绿B是一种是毒性较小的碱性染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色，其原理主要是碱性染料的胶粒表面带有阳离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。 细胞核由
2、脱氧核糖核酸和 强碱性的组蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所组成，在DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的碱性染料以离子或氢键结合而被染色，此外，由于核蛋白中还有少量的弱酸性物质，因此，詹纳斯绿B也能被堆积下来而使细胞核呈现蓝色。 线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶,该酶能使脂溶性的詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色. 线粒体能在詹纳斯绿B染液中维持活性数小时，通过染色，可以在高倍显微镜下观察到生活状态的线粒体的形态和分布；,詹纳斯绿B(Janus green B),性状:棕色呈深棕色结晶性粉末，溶于水呈蓝色，
3、微溶于醇。 用途:用于线粒体活体染色，真菌和原虫染色，胚胎切片染色，以及用作氧化还原指示剂和铜的电镀添加剂 碱性染料的胶粒表面带有阳离子，而被染部分本身具有阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来,分子结构式,分子式：C30H31ClN6,活体染色,活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。,活体染色,根据所用染色剂的性质和染色方法不同，通常把活体染色分为体内活染和体外活染两类。 体内活体染色
4、：是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。 体外活体染色(超活染色)：它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 作为活体染色剂：对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总要配成稀淡的溶液来使用。 活体染料多为碱性染料,如中性红,詹纳斯绿B,次甲基蓝等 对某种细胞器的染色具有专一性,如中性红染液泡, Janus green B染线粒体。,实验用品,实验材料 小白鼠肝脏 人口腔粘膜上皮细胞,用颈椎脱臼法处死小鼠，置于解剖盘中剪开腹腔，取小白鼠肝剪成小块放入小烧杯内用吸管吸取生理盐水
5、，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。,实验用品,实验试剂 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4) 0.2%和0.02%詹纳斯绿B(Janus green B)染液 生理盐水 实验仪器：显微镜，高速冷冻离心机,玻璃匀浆器,解剖刀，剪刀，漏斗，尼龙网，刻度离心管等,实验内容,小鼠细胞器(细胞核,线粒体)的分离提取 分离提取物(细胞核,线粒体)鉴定 人口腔粘膜上皮细胞线粒体超活染色 密度梯度离心法纯化线粒体(),1.细胞器(细胞核,线粒体)的分离提取 (1）获取肝脏：用颈椎脱臼法处死小鼠,置于解剖盘中剪开腹腔,迅速取出小鼠肝,称重1克放入小烧杯内用
6、吸管吸取预冷的生理盐水洗净血液。 (2）匀浆：将鼠肝剪碎置于预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液中洗涤数次至鼠肝发白。然后置于匀浆器中，加入10ml预冷的0.25mol/L蔗糖缓冲液匀浆至肝组织基本碎裂(分次加入匀浆液)。（注：整过程在冰浴上进行） (3）过滤：双层尼龙布将匀浆液过滤到预冷的小烧杯中。,实验步骤,（4）细胞核与线粒体分离：,沉淀2（制1张装片C，做好标记） （细胞核及碎片）,上清液2（制1张装片D，做好标记）,上清液1与上清2合并， 11000 g离心10min,沉淀3（制1张装片E，做好标记） （线粒体）,要进一步得到更纯的线粒体可再洗涤两次或密度梯度离心法纯化,注意：沉淀与上
7、清液从离心机取出后均要置于冰浴上,2.分离提取物鉴定 将共5张制片，不待干即滴加0.2%Janus greenB染色20min后（暗处反应）,盖上盖玻片，镜检，分散相的线粒体被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒。如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认。 装片中的细胞核，也被染成较深的蓝色，而血细胞不着色。 注意：得到的沉淀物须加预冷0.25mol/L蔗糖缓冲液将其悬浮后再装片，制线粒体装片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。,实验步骤,实验步骤,3.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察 将载玻片(必须十分清洁)平放在桌面上，滴2滴0.02%詹纳斯绿B染液于载玻片中央； 用
8、消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口腔上皮细胞(粘液状物)，均匀地涂布在载玻片上的染液中，染色5-15min (注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干； 低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体 。,实验步骤,4.密度梯度离心法纯化线粒体(自选),35,000rpm/1h,使用超高速离心机,实验结果,图2：人口腔粘膜上皮细胞(示线粒体),图1：小鼠肝细胞核,在光学显微镜油镜下进行观察：功能完整的线粒体呈现蓝绿色圆形或棒状颗粒（绿色箭头所指） （注
9、意：可见蓝绿色渐渐变淡现象，蓝绿色强度显著减弱或呈现无色，表明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不全或功能丧失 ）,注：红色箭头所指为细胞核,在显微镜下观察到的离体线粒体,匀浆缓冲液预冷(4 ) 冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直揷入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞 (适度研磨)，缩短匀浆时间。 试验全过程要在04进行,离心机温度设为 4 整个分离过程不宜过长,要尽快。 离心机使用：离心管要平衡 g为离心力(RCF) RCF(g)=1.11810-5 r (rpm)2 r:有效半径(cm), rpm:转速(转/分),注意事项,只有2台可用的冷冻离心机，每一次的离心时间较长，因此，全班同学要配合好，每次运转务必满负荷.,1.分别描述五张装片的结果(如逐级分离中看到哪些细胞组分，平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少，等) 2.根据你的实验结果和你所获得的知识,你认为用此分离方法所分离的线粒体的纯度如何?有什么改进方法？ 3.绘出人口腔粘膜上皮细胞图(示线粒体的形态与分布),实验报告,