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1、生物材料,DNA,mRNA,一定大小范围DNA,PCR,cDNA(互补DNA),反转录,基因组文库 cDNA文库,基因文库,包括,人工合成,限制酶切割,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,得到转基因生物,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,生物材料,PCR,cDNA,mRNA,DNA,基因组文库,cDNA文库,一定大小范围DNA,人工合成,逆转录,限制酶切割,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,得到转基因生物,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,基因文库(gene library)概念,又称DNA文库,是指某个生
2、物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后,转化宿主细胞,通过筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体),所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主细胞组成。,mRNA 结构图,DNA 结构图,基因组文库(Genomic library),将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段,再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。该文库以DNA片段的形式贮存着该生物全部基因组的信息,可用于分离目的基因和保存某种生物的全部基因。,基因组文库,cDNA文库 (cDNA library),提取某生
3、物组织或发育时期的总mRNA,经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,储存于受体菌中,该群体就称该生物基因组的cDNA文库。 cDNA(complementary DNA,互补DNA):是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,cDNA文库,反转录酶,cDNA,克隆、转化、培养、鉴定,构建基因文库的基本程序,1)提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的DNA片段,或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA; 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA; 3)重组DNA
4、转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌; 4)阳性重组菌落或噬菌斑的筛选。,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组文库的类型,根据所选用的载体可以分为: 质粒文库、噬菌体文库、人工染色体文库(细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库)。,基因组文库的质量标准,一个理想的基因组文库应具备下列条件: 重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力; 载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆; 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序; 克隆片段易于从载体分子上完整卸下; 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。,cDNA文库的主要优点,cDNA文库特别适用于某些RNA病毒的基因组结构研究
5、及有关基因的克隆分离; cDNA文库较小,易于筛选; cDNA文库可用于在细菌中表达真核生物的基因; cDNA文库结合基因组文库可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。,cDNA克隆的主要的缺点,cDNA文库所包含的遗传信息远少于基因组DNA文库,并且受细胞来源或发育时期的影响; cDNA文库不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息; 在cDNA文库中,高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高,分离起来比较容易,而低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低,因此分离也就比较困难。,从基因文库中筛选目的基因,1.通过克隆序列筛选:核酸杂交(探针)和PCR(
6、引物) 2.通过表达产物筛选:免疫学检测(抗原抗体反应),探针,探针是一小段带标记的单链DNA或者RNA片段(大约是20到500bp), 用于检测与其互补的核酸序列。 最初是使用带放射性的DNA探针,通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法,将探针核苷酸的侧链加以改造,探针杂交后,其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别,从而显示出位置。,菌落原位杂交法(核酸杂交),直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有目的序列的菌落。,对应的菌斑或噬菌斑位置不变,可以直接找出阳性菌落。,特点:,PCR筛选法,利用合适的
7、引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因序列所在克隆。,免疫筛选法,放射性抗体检测法,滤膜(固定抗体),+,免疫沉淀检测法,菌落,沉淀素,高等生物的基因组DNA十分复杂,单个基因在基因组或某个特定发育阶段或特定组织中所占比例很小。因此,要想从庞大的基因组中分离某个特定的未知基因非常困难,因此先把材料DNA分成若干易于处理的片段,然后确定目标序列在哪一片段,再进一步从该片段寻找目标序列,事情就变得容易了。,为什么要建基因文库?,PCR法获取目的基因,已知基因: 设计合成一对引物,直接从基因组DNA(或文库)中扩增该目的基因。 未知基因:
8、参照其他物种中该基因的两末端设计引物,从基因组DNA(或文库)中扩增该目的基因; 依照其他物种中该基因的保守区段序列设计引物,扩增出一段DNA,标记为探针,从基因组文库、cDNA文库中钓出该基因。 PCR法获取目的基因的前提是:要有足够制备合适引物的信息,PCR法获取目的基因优点,1.简便快速:在有足够引物信息的情况下,可直接从基因组DNA中克隆目的基因,大大减少了基因分离的工作量; 2.灵敏度高:可从极微量的模板扩增出目的片段; 3.对起始材料质量要求低:由于其灵敏度高和特异性强,极微量的材料或者混合的组织、部分已降解的DNA材料都可以作为起始材料; 4.也可用于基因文库的构建。,化学合成制
9、备目的基因,磷酸二酯法 亚磷酸三酯法,获取目的基因的方法,一般来说: 目的基因的获得通常采用PCR法;化学合成法由于合成的片段较短,一般用于引物和探针的合成;基因文库一般用于保存基因资源。,目的基因检测与鉴定,通常采用分子杂交的方法。 分子杂交:采用已知标记的核酸分子或蛋白质分子检测混合样品中未知核酸分子或蛋白质分子。 根据其检测对象的不同可分为 Southern 杂交(DNA)、Northern 杂交(RNA)和 Western 杂交 (蛋白质)。,分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行,也可以在蛋白质与蛋白质之间进行。 核酸分子杂交是指核酸分子(DNA
10、或RNA)在变性以后,在复性的过程中两个不同来源的且同源的核酸分子形成杂合双链的过程。 蛋白质之间的杂交通过抗原抗体反应进行。,公元11年（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） (西汉王莽新朝三年)，是中国古老的实证医学萌芽。由于儒、释、道三教合流所形成的中国文化格局，“重道轻器” （45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）衍生出的务虚倾向，重体悟而疏实证，必然缺少逻辑推理，致使中国的实证医学成就在日后难以与西方医学同日而语。古埃及医师运用念咒、画符和草药治病，前二者就是巫医。（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）西医在古希腊时期就
11、开始医巫分家，亚里士多德曾详细描述了动物的内脏和器官，古希腊医学最高成就的代表人物希波克拉底将唯物主义哲学运用于医学之中，在论圣病中说：“被人们称为神圣的疾病(指癫痫和一些精神患者)，在我看来一点也不比其他病症更神、更圣，与其他任何疾病一样起源于自然的原因。只因这些病症状奇异，而人们对它们又一无所知，充满疑惑，故而将其原因和性质归之于神灵。”亚里士多德所创立的唯物主义医学体系，加快了医学科学化的进程；（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） （df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2） 非凡（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）的事件
12、都集中发生在这个时期。并且是独立地发生在中国、印度和西方”。这一阶段，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）是东、西方哲学、科学、文化发展的重要时期。此时诸子蜂起，儒家、墨家、道家、法家学派林立，形成了空前绝后的学术繁荣局面，对中华文化的发展起了奠基作用；处在古典希腊文明的开创时期，（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）出现了德谟克利特、费底亚斯、阿基米德、苏格拉底等哲人和智者。在东、西方科学和文化昌明的大背景下，（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 黄帝内经和希波克拉底全集代表着中、西两座医学的峰巅之作便自然而
13、然的诞生了。内经的问世，标志着中医学已从简单的临床经验积累，升华到系统的理论总结。关于希波克拉底全集，意大利著名医史学家卡斯蒂格略尼认为：“是自然科学几乎（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）没有萌芽的时代，在医术上具有先进性的最宝贵的代表文献。希波克拉底学派的医学虽然在解剖学、生理学、病理学的知识上有缺陷，虽然只是很少而粗略地研究过动物，但是它主要是建立在临床实验和哲学推理的基础上，终能使医学提高到难以超过的高度。这是历史上最有意义的现象之一，并可能是最重要的，因为（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）它说明通过经验，（df肺25s血液f369血小板t517
14、2红血球gdf55m白血球fd2）实际观察和正确的推理，可以得到极有价值的宝贵材料，他的确解决了医学历史上具有决定性倾向的开端。”比较黄帝内经和希波克拉底全集，二者的理论建构有诸多相似之处：废巫存医、整体观念、调节平衡、哲学思辩、临床实践。（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 其中黄帝内经（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）强调以五脏为中心的整体观，从外测内，可以不依赖解剖形态学而照样诊治疾病。其理论体系是自洽的，难以突破；希波克拉底全集虽然没有系统的解剖学和生理学等基础知识，但却强调具体的解剖结构，为医学的实证开了先河。这些差异为中、西医学的日
15、后分向而行埋下了伏笔。 （df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr） 医学教材 东、西方文化历史背景是中、西医学形成、发展的土壤。公元2世纪东、西方的两位医学巨匠张仲景和盖伦，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）传承了不同的学术思想，创建了迥异的医学范式，发展和完善了不同的理论体系，使中、西医学各自走向了两条完全不同的发展道路。（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2） 在汉代医学家张仲景所著述的伤寒杂病论之前，就有内经、难经、本草经等古典医药典籍。张仲景总结了汉代以前的医学成就，继承了内经等基本理论和丰富的医药知识，结合自己的临床实践，写成
16、了伤寒杂病论。其贡献在于确立了中医学辨证论治的理论体系，为后世中医临床医学的发展，奠定了坚实的基础。（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 在西方，盖伦的一生生活在罗马帝国时安东尼父子的执政期。彼时，罗马帝国的繁荣，为盖伦的医学成就、以及西方医学的（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）昌盛，提供了可靠的政治、经济（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）、科技和文化保证。（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 盖伦继承希波克拉底的学术思想，著述200余部著作，现存的83部著作中，内容涉及解剖、生理、病理、卫生、药物、希波克
17、拉底文集研究、哲学、（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）语言学、逻辑学、数学、历史、法律等。倡导实证医学，他的科学方法论具有重视实验、（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）疾病局部定位思想、重视形式逻辑、强调演绎法等特点，对后世西医学的发展影响深远。 （4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 中、西医学在张仲景和盖伦完全相悖的医学范式引导下，开始步入了分道扬镳的历史进程。在中华文化强调（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh） “中和”的大背景下，学术界便有了“海纳百川”的宽松气氛。出现了学术流派
18、精彩分呈，如瘟病的寒温之争，经方时方之别等。中医学按张仲景的思维范式，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）蓬蓬勃勃的发展起来了。随着科学的进步和社会的发展特别是医疗实践的发展，最初的中医学理论已无法诠释新的科学事实，因此，医学理论必须不断创新，才能适应社会需要，这就促使中医学进入汉代以后，呈现出全面发展的阶段，这个阶段共包括四个时期：（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 编辑本段魏晋隋唐时期 由于重视总结临床经验，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）并继承整理发挥（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）黄帝内经、伤寒杂病
19、论等经典医著的理论，出现了众多名医名著。如晋代王叔和的脉经和皇甫谧的针灸甲乙经、隋代巢元方的诸病源候论、唐代孙思邈的千金要方和千金翼方。（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 编辑本段宋金元时期 我国经济和科学技术日益发展，学术文化领域百家争鸣，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）特别是思想家的革新精神，为中医学理论的创新和突破性进展，提供了有利的文化背景。宋代陈无择著三因极一病证方论一书，（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）提出三因学说；并产生了最具盛名四大学派，刘完素倡导火热论；张从正力倡“攻邪论”；李杲提出“内伤脾胃，
20、百病由生”的理论；朱震亨创造性地阐明了相火的演变规律。 编辑本段明清时期（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2） 是中医学理论综合汇编、深化发展，临床各科辨证体系丰富、提高阶段。如明代楼英的医学纲目和王肯堂的证治准绳，清代吴谦等编著的医宗金鉴和陈梦雷主编的古今图书集成医部全录等。王清任著医林改错，注重实证研究，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）纠正了古医籍中关于解剖知识的某些错误，肯定了“脑主思维”，发展了瘀血理论。温病学说的形成和发展，标志着中医理论的创新与突破，吴有性著温疫论，叶天士著温热病篇，吴鞠通著温病条辨等，在药物学研究方面，（45传
21、染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）李时珍著的本草纲目，总结了16世纪以前我国药物学研究的成就。 而西方医学随着西罗马帝国的灭亡，逐渐进入了中世纪的千年黑暗，科学变成了神学的奴婢，牧师取代医师。（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 从13世纪开始，始渐复明，直到15世纪，冲破封建宗教藩篱，才得以迅速发展。达芬奇（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）开创现代解剖学，维萨里创立解剖生理学；1731年意大利摩尔干尼创立了病理解剖学；1855年德国魏尔啸创建了细胞病理学；与此同时西方科学方法论对医学发展具有指导作用。以实验为主的实证方法(观
22、察实验和比较分析)、（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）及对医学研究中的“经院哲学”的彻底决裂、依靠各门自然科学所提供的技术手段和方法，（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 培养了医学家们的科学意识，赋予了医学的自然科学属性，使其摆脱了思辩推理的玄想而成就了生物医学模式下的实验科学。至此中医学在实证医学领域已无法于西医同日而语。但中医学相对于西医学的（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）优势是从宏观入手，注重整体，强调局部与局部、局部与整体之间的联系，重视辨证，主张“三因治宜”的个体化诊疗方略等。 编辑本段东西方医学差异 中、西医学
23、运用不同的思维模式诊治疾病，其基本理论各成体系并有根本差异。（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）中西医学的差异不仅仅是有否实证的科学理念，最主要的是两种文化体系的差别。从理论上讲，中西医学是两种不可能统一的医学体系。“中体西用”曾成为中西医汇通派的指导思想，但由于两种医学的根基不同，硬在中医之体上套上西医之用，近一个世纪的事实证明，“汇通医学的体用判断脱离了中西医学的事实认识，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）以价值认识代替了事实认识，决定最终结果劳而无功”，因此，中、西医学应并存共荣而不必强求统一。 （df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 尽
24、管目前中、西医学还不可能融合成为一种统一的医学模式，但可以独立发展，并存共荣，整合互补。（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）缘于现代信息论、（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）系统论和控制论的影响，西医学的发展趋势若仅仅是单纯地重视分析而忽略了整体结构和整体功能，无疑将渐行渐窄。而中医讲究“感悟”，（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 未免夹带有很多主观因素，难以客观地定量，定性。若中医的诊察疾病能参考现代医学的微观分析，将辨证与辨病相结合，实现宏观与微观的统一，使中医诊断客观化，即把分析与综合相结
25、合的方法引入中医理、法、方、药的研究，使二者有机结合，互相借鉴、补充，避免各自的片面性、局限性，这将有利于中西医学的优势互补，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr） “和而不同”，多元发展。近年来，中医药在防治非典、禽流感和艾滋病方面发挥的独特作用也证实了二者的有机结合，具有肯定的临床疗效。 编辑本段东西方医学交融（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr） 不管是中医学还是西医学，从二者现有的思维方式的发展趋势来看，均是走向现代系统论思维，中医药学理论与现代科学体系（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）之间具有系统同型性，属于本质相同而描述表达方式不同
26、的两种科学形式。可望在现代系统论思维上实现交融或统一，成为中西医在新的发展水平上实现交融或统一的支撑点，希冀籍此能给（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）中医学以至生命科学带来良好的发展机遇，进而对医学理论带来新的革命。 编辑本段现代中医史（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6）轴心时代中、西医学的峰巅之作。雅斯贝而斯曾说：“如果历史有一个轴心，那么我们就必须将这轴心作为一系列对全部人类都有意义的事件，发生于公元前800至200年间的这种精神历程似乎构成了这样一个轴心。,医学健康系列精品课件,本文档下载后可以修改编辑，欢迎下载收藏。,通常通过各种方法将核酸(蛋白质)分子固定
27、在固相支持物上,然后用放射性元素等标记的探针(抗体)与被固定的分子杂交,经显影(显色)后显示出目的核酸(蛋白质)分子。,Southern杂交的操作步骤,(1) 酶切DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。 (2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。 (3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。 (5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。,将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上,进行核酸杂交的一种实验方法。,Northern杂交,Northern杂交的过程,提
28、取总RNA 分离mRNA,利用亲和层析的原理纯化mRNA。 制备RNA探针,根据mRNA序列合成同源DNA探针,或以cDNA为探针。 Northern杂交,通过显影检查目的DNA所在的位置。,Southern杂交和Northern杂交过程示意图,Western杂交,中文一般称为蛋白质印迹技术。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳分离的细胞或生物组织蛋白样品进行检测。 Western Blot与Southern杂交或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。,Western杂交过程,经过SDS-PA
29、GE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜)上,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的目的蛋白。根据检测结果,从而可得知被检细胞内目的蛋白表达与否、表达量及分子量等情况。,第一步 抗体识别抗原,第二步 第二抗体识别第一抗体,第三步 颜色反应,Western杂交结果图,建立文库需要重组子的数目,N=ln(1-P)/ln(1-1/n) N:重组子数目; P:文库中包括任意DNA片段的概率; n:总基因组碱基数/克隆片段碱基数。 例:假如重组片段大小为20kb,要使文库包含该基因组任一片段的
30、概率达到99,则 N大肠杆菌=ln(1-0.99)/ln(1-1/4.6/20103)=1.1103 N人=ln(1-0.99)/ln(1-1/2.8/20106)=6.5105,常见载体容量,(二)细胞工程,细胞融合与单克隆抗体,细胞融合(cell fusion),又称体细胞杂交(somatic hybridiazation),是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合,形成单个细胞的过程。,细胞融合的意义,理论上说任何细胞,都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。 绕开了种间生殖隔离的限制,为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生
31、的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统,在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组,从而产生新的核外遗传系统。 淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。,显微镜下细胞融合过程,细胞融合的常用方法,一、灭活病毒法 两种细胞在一起培养,加入灭活病毒,在4条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚; 在37中,病毒与细胞膜发生反应,细胞膜受到破环,此时需要Ca2+和Mg2+,最适PH为8.0一8.2; 细胞膜连接部穿通,周边连接部修复,此时需Ca2+和ATP; 融合成大细胞,需ATP 。,二、聚乙二醇(PEG)法,PEG,PEG分子式:HOH2C(CH20CH2)nCH2OH,分子量大
32、于200小于6000者均可用作细胞融合剂. PEG分子具有轻微的负极性,故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键,从而在在质膜之间形成分子桥,其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合.,PEG诱导融合的特点:其优点是融合成本低,不需特殊设备;融合子异核率较高;融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害。,三、电融合法,电融合法是在直流电脉冲的诱导下,细胞膜表面的氧化还原电位发生改变,使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂,进而质膜开始连接,直到闭和成完整的膜,形成融合体。 电融合法的优点: 融合率高,重复性强,对细胞伤害小; 装置精巧,方法简单,可在显微镜
33、下观察或录像观察融合过程; 免去PEG诱导后的洗涤过程,诱导过程可控性强。,细胞杂交瘤技术与单克隆抗体,抗体,由抗原刺激B淋巴细胞产生的,并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。,抗原决定簇,抗原分子中存在的能与抗体Fab片段特异性结合的特殊化学基团,是免疫应答特异性的物质基础。,构象决定簇与线性决定簇,单克隆抗体,定义:由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的高度特异性的抗体。每种单克隆抗体其分子结构完全相同。,多克隆抗体,定义:抗原分子通常具有多个抗原决定簇,动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答,因而可产生多种针对不同抗原决
34、定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体(polycolonal antibody, PcAb)。,单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞,杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖,又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此,单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。,骨髓瘤细胞选择,骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 选择次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型(HGPRT-)或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型(TK-)瘤细胞,在旁路合成途径中,HGPRT负责催化磷酸核糖焦磷酸和嘌呤基形成嘌呤单磷酸核苷酸,而TK可催化胸苷转化为5-单磷酸胸苷,作为胸苷脱氧核
35、苷酸合成的材料。,HAT选择培养基,含次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的培养基,是动物杂交细胞筛选中最常用的方法。在这种培养基中细胞只能利用旁路途径合成DNA,因而只有具有HGPRT+或/和TK+的细胞才能生长。,细胞内DNA的合成途径,从头合成途径:以氨基酸和其他小分子起始合成核苷酸,进而合成DNA 的过程;可被叶酸类似物氨基蝶呤(A)阻断; 旁路合成途径:胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(TK)利用胸腺嘧啶核苷(T)合成DNA;次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)利用次黄嘌呤(H)合成DNA。,单克隆抗体的大量制备,体内法:单克隆细胞注入到小鼠腹腔培养; 细胞培养:体外克隆培养.,单
36、克隆抗体的应用,1. 作为亲合层析的配体 单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合,因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体,利用它作为配体,固定在层析柱上,通过亲合层析,即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱,就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比,具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。,2. 作为生物治疗的导向武器,将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接,利用单克隆抗体的导向作用,将化疗药物或放疗物质携带至靶器官,可直接杀伤靶细胞。 另外,将放射性标记物与单克
37、隆抗体连接,注入患者体内可进行放射免疫显像,协助肿瘤的诊断。,治疗用脂质体,3.检验医学诊断试剂,单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点,广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术,目前,应用单克隆抗体制作的商品化试剂盒广泛应用于:病原微生物抗原、抗体的检测;肿瘤抗原的检测;免疫细胞及其亚群的检测;激素测定;细胞因子的测定。,4. 作为研究抗原的探针,例如前面讲的Western blotting。,5. 作为免疫抑制剂,抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂,已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗,
38、可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外,对用于同种骨髓移植的供体骨髓,在体外经抗T细胞单抗加补体处理,能减轻移植物抗宿主病的发生。,谢谢！,西医学是最近三四百年来建立在解剖学、生物学及现代科学技术基础上、发展起来的一门以“解剖人、肉体人”为概念的、新兴的现代医学科学理论体系。主要采用科学实验方法，从宏观到微观，直至目前的分子基因层次水平，发展极为迅速，超过其它任何一门医学科学，成为世界医学史上的主流。 可见中西医学，一个是以“功能人”为概念的独特的哲学医学理论体系，一个是以“解剖人、肉体人”为概念的新兴的现代医学科学理论体系，二者都不是以完整人为研究对象的科学，从理论讲二者都不是科学的，势必
39、影响各自发展。事实也证明这一切，中医长期停滞不前、疗效也不确实。西医尽管发展到目前的基因分子层次，但疾病发病率居高不下，对绝大部分疾病发病原因认识不清、发病机理弄不明白，治疗受到制约，在小小SARS、禽流感面前竟束手无策，在糖尿病、癌症、心脑血管疾病、尿毒症等相当多疾病面前更是不得不求助或借助中医治疗。一个是疗效不确实，一个是有些甚至相当多疾病无法治疗，这就是中西医学结合的缘由。然而，由于二者是两套理论、两股道上跑的车，风马牛不相及，从理论上讲就没有结合的可能，只是形式上的融合罢了。故出现西医对治疗不了的疾病只好求助中医，而中医则往往采用西医诊断中医治疗，以及中西治疗法一块用的局面。 至于循证
40、医学、比较医学、后现代医学、行为医学等所谓“医学”，都称不上一门独立的医学科学，关于这一点在灵魂医学有关章节中将有相关点评。 现今医学分为传统医学、基于“生物-医学模式”近代发展起来的西医，20世纪西医又发展到“社会-心理-生物医学” （df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）或综合医学模式，后基因组时代系统生物学的兴起，（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）形成了系统医学在全球的迅速发展，成为继传统医学、西医学之后中、西医学汇通的未来医学。当代中国医学类专业比较优秀的学校有北京大学、（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 华中科技
41、大学、郑州大学等学校。 （df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2） 中医即中国传统医药学，是形成于数千年前的中国，是建立在人们与疾病长期斗争的经验总结及阴阳五行、八纲脏腑辨证基础上，运用朴素辩证法及思辨推理方法，认识机体、自然、疾病三者关系，发展起来的（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）一门以“功能人”包括功能脏器为概念的独特的医学哲学理论体系。（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 在治疗上，除了药物外，还有针灸、推拿气功、（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）耳针等特殊疗法，它是世界传统医学中最完善的一种医学理论
42、体系。它为人类尤其为中国人民（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 健康和民族繁衍做出了巨大贡献。 （df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2） 西医学是最近三四百年来建立在解剖学、生物学及现代科学技术基础上、发展起来的一门以“解剖人、肉体人”为概念的、新兴的现代医学科学理论体系。主要采用科学实验方法，从宏观到微观，直至目前的分子基因层次水平，发展极为迅速，超过其它任何一门医学科学，成为世界医学史上的主流。 可见中西医学，一个是以“功能人”为概念的独特的哲学医学理论体系，一个是以“解剖人、肉体人”为概念的新兴的现代医学科学理论体系，
43、二者都不是以完整人为研究对象的科学，从理论讲二者都不是科学的，势必影响各自发展。事实也证明这一切，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）中医长期停滞不前、（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）疗效也不确实。西医尽管发展到目前的基因分子层次，但疾病发病率居高不下，对绝大部分疾病发病原因认识不清、发病机理弄不明白，治疗受到制约，在小小SARS、禽流感面前竟束手无策，在糖尿病、癌症、心脑血管疾病、尿毒症等相当多疾病面前更是不得不求助或借助中医治疗。一个是疗效不确实，一个是有些甚至相当多疾病无法治疗，这就是中西医学结合的缘由。然而，由于二者是两套理论、两股道上跑的车（df肺25
44、s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2），风马牛不相及，从理论上讲就没有结合的可能，只是形式上的融合罢了。（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 故出现西医对治疗不了的疾病只好求助中医，而中医则往往采用西医诊断中医治疗，以及中西治疗法一块用的局面。 （df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）至于（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）循证医学、比较医学、后现代医学、行为医学等所谓“医学”，都称不上一门独立的医学科学，关于这一点在灵魂医学有关章节中将有相关点评。 总之，目前以中西医学为主的世界各种医学科学都存在不完整性的瑕疵，即都是以不
45、完整的人为研究对象的医学科学，故不能解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学史上一切疑难模糊问题，成为阻碍医学科学前进的羁绊。的确，要解决目前存在于中西医学甚至人文社会科学上一切疑难模糊问题，显然已完全超出了中（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）西医学所涉及的范畴，我们必须跳出中西医学的理论框架，建立起一个新的医学理论体系 - 东方医学和西方医学（即西医）的融合形成现代系统医学。该体系所涉及的一切问题不管从广度上，还是从深度上，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）都应该远远超过现有的中西医学理论，并将现有中西医学理论纳入自己的理论框架范围之内。
46、为了肩负起这一历史使命，原创人生、医学理论体系（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 灵魂医学 soul medicine应运而生，她不但从宏观上或战略上圆满解释并解决了存在于人类医学及人文社会科学史上的一切疑难模糊问题，而且还能够使人们得以启迪人生（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh），不得不重新认识人类自身、不得不重新认识人类赖以生存的这个多维世界。（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 医学化验 医学定义（medicine），是处理人健康定义中人的生理处于良好状态相关问题的一种科学，以治疗预防生理疾病和提高人体生理机体健康为
47、目的（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）狭义的医学只（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）是疾病的治疗和机体有效功能的极限恢复，广义的医学还包括中国养生学和由此衍生的西方的营养学。现在世界上医学主要有西方微观西医学和东方宏观中医学两大系统体系。（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）医学的科学性在与应用基础医学的理论不断完善和实践的验证，（df4肺炎88gdg青霉素d25f肝炎df6） 例如生化、生理、微生物学、解剖、病理学、药理学、统计学、流行病学，中医学及中医技能等，来治疗疾病与促进健康。虽然东西方由于思维方式的不同导致
48、研究人体健康与外界联系及病理机制的宏观微观顺序不同，但在不远的将来中西医实践的丰富经验的积累和理论的（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）形成必将诞生新的医学-人类医学。 不同于现代医学，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）不同于传统中医， 金水医学诞生了，金水医学是以驱除病理，恢复生理为主张的全新医学，走出了人类医学的误区，（4f肿瘤fbb癌症yuw3胃癌d65io肠癌.f2tr肺癌65ff） 治疗疾病的特色鲜明，不论是任何疾病都能做到从危为安，由重到轻的恢复办法。金水医学认识到人体是生命体，（df高血压958心脏病983u6糖尿病87fr）生命体有自己的强大的生理自我愈合功能，帮助生命体恢复自主作用才是治疗疾病的根本。针对当今现代文明病，现代疑难病，现代慢性病，亚健康，一体多病，取得了巨大的成功，治疗法则为“胃肠洁，气血流，玄府开，营卫昌”人生命体运动符合自然节律，最终达到人体生理增强，消灭疾病的目的。 编辑本段医学的分类 医学研究 医学可分为现代医学（df肺25s血液f369血小板t5172红血球gdf55m白血球fd2）（即通常说的西医学）和传统医学（包括中医学、藏医学、蒙医学等）多种医学体系。（45传染病q566丙肝964jo乙肝28jgsx甲肝gh）不同地