植物细胞工程课件第二章细胞全能性及其生长调控-PPT文档.ppt

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1、细胞全能性及其表达,植物细胞全能性表达与调控,动物细胞全能性特性,主要内容,2.1 细胞全能性及其表达,细胞全能性概述,细胞脱分化,细胞再分化,一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。 正确理解细胞全能性的绝对性与相对性。,2.1.1 细胞全能性概述,植物细胞按照分裂能力分为三类： 第一类是始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期的周期细胞。如茎尖、根尖及形成层细胞； 第二类是永久失去分裂能力的细胞，为终端分化细胞。如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞； 第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的Go细胞。如表皮细胞及各种薄壁细胞。,一个植物细胞向分

2、生状态回复过程所能进行的程度，取决于它在自然部位上所处位置和生理状态。,植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱： 营养生长中心 形成层 薄壁细胞 厚壁细胞(木质化细胞) 特化细胞(筛管、导管细胞)； 根据细胞所处的组织不同从强到弱为： 顶端分生组织 居间分生组织 侧生分生组织 薄壁组织(基本组织) 厚角组织 输导组织 厚壁组织。,细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，在大多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前体，再分化是细胞全能性表达的最终体现。,细胞全能性概念的拓展,利用培养细胞进行次生代谢产物的生产，是将细胞全能性概念从培养细胞的营养代谢角度得到了拓展。 1984年，国际组织

3、培养协会对细胞全能性又给出了定义：细胞全能性概念为细胞的某种特征，有这种能力的细胞可保留形成有机体所有的细胞类型的能力。,次生产物,2.1.2 细胞脱分化,细胞生理与结构变化,细胞脱分化调控机理,细胞分裂与愈伤组织形成,培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化（dedifferentiation）。 离体培养下，脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前 。 静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。,细胞脱分化过程中生理和结构变化,根据脱分化细胞过程中细胞结构发生变化的时空顺序，细胞的脱分化过程可分为3个阶段：,第一阶段为启动阶段，表现为 细胞质增生，

4、并开始向细胞中 央伸出细胞质丝，液泡蛋白 体出现；,第二阶段为演变阶段，此时细 胞核开始向中央移动，质体演 变成原质体；,第三阶段为脱分化终结期，细 胞回复到分生细胞状态，细胞 分裂即将开始。,Flash,细胞脱分化的调控机理,细胞脱分化调控的实质是G0期细胞回复到分裂周期的调控过程。,细胞周期的主要调控分子： Cyclin（细胞周期蛋白） CDK（周期蛋白依赖激酶） CKI（周期蛋白依赖激酶抑制子）,植物激素与脱分化,植物激素是离体培养中所必需的条件，与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。 2,4-D诱导表达的基因par从叶肉原生质体cDNA主库中分离得到（Takahashi

5、等,1989) 花粉富含硫蛋白基因NtEPa、NtEPb、NtEPc被克隆得到，其中NtEPc的表达与BA浓度有关。,激素的作用需要受体蛋白及其它信号转导过程的参与。 促分裂肽PSK 、PSK被发现(Matsubayashi & Sakagami,1996) PSK在低细胞密度下能促进细胞启动分裂 PSK基因的表达受NAA诱导 在PSK 基因表达的同时细胞分裂才能被启动,细胞脱分化与愈伤组织形成,细胞脱分化是细胞状态的改变，但成功的脱分化必然会导致细胞分裂。,对于单个细胞而言，分化细胞启动分裂显然是发生在细胞完全脱分化之后。,在一个细胞群体培养或组织器官培养体系中，有时很难区分细胞脱分化与进入

6、增殖状态的界限。,细胞初期分裂方式与外植体细胞类型有关，如果外植体细胞均为正常二倍体细胞，第一次分裂通常是有丝分裂，如果外植体含有高倍化细胞，脱分化的第一次分裂可能是有丝分裂，也可能是无丝分裂。,细胞脱分化与愈伤组织形成,愈伤组织的形成,愈伤组织（callus）：由外植体生长得到的一团无序的薄壁细胞。,2.1.3 细胞再分化,所谓细胞分化（Differentiation），是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。 一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态和机能，这是在时间上的分化； 同一种细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态和机能，这是在空间上的分化。,从分

7、化的遗传控制角度讲，细胞分化是各个处于不同时空条件下的细胞，基因表达与修饰差异的反应，所以，分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的各种不同的表现型。 在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体，通常把离体培养下的这一过程称为再分化（redifferentiation）。,极性（polarity）是植物细胞分化中的一个基本现象。 所谓极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。 在很多情况下，细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的标志。,极性与细胞分化,2.2 植物细胞全能性表达与

8、调控,细胞分化状态调控,形态发生调控,激素是离体培养条件下调控细胞脱分化和再分化的主要因素，其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。此外，在有些试验中也显示，GA3、ABA、乙烯等也在细胞分化中起到一定调节作用。,2.2.1 激素对细胞分化的调控作用,在众多植物离体培养中证明，细胞分裂素和生长素对于细胞生长和分化具有同等重要的协同作用，它们的量与比值的不同配合，对细胞分化起着重要调节作用。,在离体条件下，如果用生长素和细胞分裂素处理的顺序不同，其作用也不一样。如果先用生长素处理，后用细胞分裂素处理，则有利于细胞分裂而不利于细胞分化；反之，则有利于细胞分化。如果

9、两者同时处理，则可促使分化频率的提高。,细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程，了解这一过程的调控机理，最终是为再生个体奠定基础。 生物个体形成是通过形态发生（morphogenesis）实现的，建立在离体培养基础上的形态发生称之为体细胞形态发生（somatic morphogenesis）。体细胞形态发生过程及其调控机理是细胞工程学研究的核心内容。,2.2.2 形态发生调控,器官发生,体细胞胚胎发生,器官发生,植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等

10、器官的过程。,器官发生方式,（引自Sunnichan, 1998; Tylicki, 2000; Zambre, 1998）,经过愈伤组织的器官发生,不经过愈伤组织的器官发生,器官发生过程,经过愈伤组织的器官发生过程,愈伤组织形成,生长中心形成,器官原基及器官形成,不经过愈伤组织的器官发生,在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基，这一途径有两种情况：,另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。,一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。,这种不经过愈伤组织直接发生器官的

11、途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义。,不经过愈伤组织的器官发生,外植体的类型,母体植物的遗传基础,起始材料对器官分化的影响,总体上说，被子植物比裸子植物容易培养，在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培养成功的报道最多。通常情况下，自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力。,基因型对于培养反应的差异，器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。,同种植物不同品种（基因型）的培养效果具有较大差异已是不争的事实。,外植体对诱导反应及其再生能力的影响体还现在生理状态上。,一、二年生无性繁殖植物的取材则可塑性较大，但仍以自然繁殖器官为外

12、植体更易成功。,对于多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。,来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养。,激素对器官发生的影响,离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物激素而实现的。在众多的植物激素中，生长素与细胞分裂素是2类主要的植物激素，在离体器官分化调控中占有主导地位。 GA3, PSK在器官分化中也具有一定调控作用。,（引自Pierik, 1987）,生长素/细胞分裂素高 有利于根分化 生长素/细胞分裂素低 有利于芽分化 生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体,光照是离体培养中比较复杂的调节因子，光照时间、强度以及光质队器官

13、分化均有影响。,光照对器官分化的影响,连续的光照有利于培养细胞维管组织的形成，而一定的昼夜光照周期则有利于极性建立和形态发生。,培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。 光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。 光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。,体细胞胚胎发生,离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。,这一定义有以下几方面的界定： 其一，体细胞胚是离体培养的产物，

14、只限于离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚； 其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚； 其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。,体细胞胚胎发生,直接途径,间接途径,一. 体细胞胚的形成,体细胞胚从外植体上直接发生,1.诱导阶段,2. 胚胎发育阶段,（引自Chen等,1999）,经过愈伤组织的体细胞胚形成,经过悬浮细胞的体细胞胚形成,间接发生,诱导愈伤组织形成,愈伤组织胚性化,球性胚形成,子叶胚期,（引自Lin等，2000）,体细胞胚发育的细胞学特点,体细胞胚的结构特点,二. 体细胞胚的发育与结构特点,类似于植物合子胚的发育,（引自Figueroa等，

15、2002）,结 构 特 点,与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点： 一是体细胞胚具有双极性（doulble polarity）； 二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现所谓的生理隔离（physiological isolation）现象。,与合子胚比较：,合子胚在胚胎发育完全进入子叶期胚以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠，而体细胞胚则直接形成植株，在不同的培养条件和植株种类中，形成植株的胚胎时期有所不同，一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植株。,与相同植物比较体细胞胚的体积明显小于合子胚，在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异。并且，体

16、细胞胚不能有明显的脱水干燥过程。,合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，体细胞胚的子叶常不规范。,合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。,三. 影响体细胞胚发生的因素,激素的调控作用,培养基及培养条件的影响,基因型的影响,2.3 动物细胞全能性特性,动物细胞特点,动物细胞全能性的 局限性和可塑性,2.3.1 动物细胞的特点,动物细胞与植物细胞比较,动物细胞在活体内的特性,培养条件下动物细胞生长特性,培养条件下动物细胞生理特性,一. 动物细胞与植物细胞比较,二. 动物细胞在活体内的特性,在活体内，动物细胞在胚胎期即已高度分化，而且这种分化是不可逆

17、转的。 一经分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，同时也具有明显的形态特征。,如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能；神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激；红细胞呈园盘状，使其与外界接触面相对地增大，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动；而上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。,活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类： 第一类是能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞； 第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞； 第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到

18、刺激后，则重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。 第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。,三. 培养条件下动物细胞的生长特性,离体培养的动物细胞可分为： 贴壁依赖型(anchorage-dependent) 非贴壁依赖型(anchorage-independent) 兼性贴壁细胞,1.贴壁依赖型 简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型、上皮细胞型。 成纤维细胞型 这种细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞内呈梭形或不规则三角形，中央有园形核，胞质向外伸出23个长短不同的突起。细胞群常原生质突连接成网，生长时呈放射状或火焰状。除真正的成纤细胞外，心肌、平滑肌、成骨肌细胞培养时均属这一类型。 上皮细

19、胞型 细胞培养时呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如皮肤表皮细胞、肝细胞、胰脏细胞和肺泡上皮细胞的培养细胞。,2.非贴壁依赖型 也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬殊浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞。许多肿瘤细胞等均属于此类，细胞一般呈圆形。 3.兼性贴壁细胞 动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。,1、成纤维细胞型 2、上皮细胞型 3、游走细胞型 4、多型性细胞型,四. 培养条件下动物细胞的生理特点,1. 动物细胞的分裂周期长 动物细胞分裂周期一般为1248小时，

20、它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。,2接触抑制(contact inhibition)现象 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。,3有限细胞系和永久细胞系 动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养（primary culture）。 经继代培养后即成为有限细胞系

21、(finite cell line)。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，经过运动世代后细胞将逐渐死亡。 继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。,大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为

22、体外转化(in vitro transformation)。,细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比； 生长速率增加，倍增时间缩短； 对血清的依赖性减小； 贴壁依赖性降低； 细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。,永久细胞系有如下特征：,4动物细胞的环境敏感性 动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。 动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。 动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。,随着胚胎的发育，高等动物的细胞失去了发育成完整个体的能力，由全能性(totipo

23、tency)变成多能性(pluripotency)，进而变成单能性(monopotency)。 如囊胚阶段的小鼠原始外胚层细胞能分化成包括生殖细胞在内的各种组织细胞，而成体中的表皮干细胞就只能分化形成皮肤细胞了。 由此可见，在发育过程中，随着细胞的分化，细胞的分化潜能逐渐变窄。,2.3.2 动物全能性的局限性和可塑性,受精卵的全能性,干细胞分化潜能,造血干细胞的分化,天津市脐血干细胞库,动物细胞的全能性随着细胞分化程度提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。可是细胞核则不同，它含有物种的全套基因，并没有因细胞分化而丢弃基因，因此高度分化细胞的核仍具有全能性。,“多利”绵羊证明了一

24、个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细胞恢复了失去的全能性形成完整个体。这就是说哺乳动物业已分化的细胞不具有细胞全能性的传统概念，在一定条件下是可塑的。,例题辨析,1、下列有关细胞全能性的含义，正确的是：,A、每个生物体内的所有细胞都具有相同的功能,B、生物体内的任何一个细胞可以完成该个体的全部功能,C、生物体的每一个活细胞都具有发育成完整个体的潜能,D、 生物体的每个细胞都经过产生、分裂、分化、生长、衰老、死亡的全过程,2、在生物体内，细胞没有表现出全能性，而是分化为不同的组织、器官，是因为：,A、细胞丧失了全能性,B、基因的表达有选择性,C、不同的细胞内基因不完全相同,3、植物组织培养形成的愈伤组织进行培养， 又可以分化形成根、芽等器官，这一过程称为：,4、下列不能作为植物组织培养的材料是：,