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1、流式细胞仪的原理,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选;研究对象多为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等；研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。,流式细胞术的基本概念,CD:是cluster of differentiation 的缩写，指的是分化群或分化簇，即将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原归为一个分化群，每一CD分子代表一种或一类分化抗原。 Antibody：抗体是能与抗原特异性结合并具有免疫活
2、性的球蛋白。它一般是由抗原刺激B细胞分化成浆细胞后产生的。抗体分子具有结合部位(结合簇)，能与对应的抗原决定簇结合。抗体与不同的抗原结合往往出现不同的反应，因而常给抗体以不同的名称，如凝集素、沉淀素、抗毒素、溶血素、溶菌素等。,流式细胞术的基本概念,Fluorescein ：荧光素，是指在一定波长的电磁波（常为蓝光或紫外光）照射下能发出荧光的一类染料 ；常见的荧光素有异硫氰酸荧光素 ( fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白（R-Phycoerythrin,R-PE）、别藻青蛋白（allophycocyanin,APC）、多甲藻叶绿素蛋白（ peridin
3、in chlorophyll protein, PerCP）等。,流式细胞术的特点,极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。 可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。 定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量
4、分析 强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选,流式细胞仪的检测范围,细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体,当前流式细胞分析发展趋势,从相对细胞计数到绝对细胞计数 从相对定量到绝对定量分析 从单色到多色荧光分析 从细胞膜成分到细胞内成分分析 从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析,光学系统 鞘流系统 电子系统 计算机系统 数据转换处理系统,流式细胞仪的组成,光学系统：,激发光源：弧光灯和激光两大类 激光优点：稳定性好、能量高、
5、发散角小； 激光分类：气体激光器、染料激光器、半导体激光器 气体激光器：氩离子激光（488nm） 氪离子激光（647nm） 氦-氖激光（633nm） FACSCaliburTM 采用了氩离子激光（488nm）和波长为635nm的半导体激光器。,光信号检测 散射光信号,Right Angle Light Detector Cell Complexity SSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC,
6、 Side Scatter） 细胞粒度及细胞内相对复杂性,Laser,FALS Sensor,光信号检测,荧光信号 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,光信号检测 常见荧光染料的发射波长,光信号收集,分光镜 滤光镜：长通（LP） 短通（SP） 带通（BP） 光电信号转换：光电倍增管（PMT） 光电二极管,荧光补偿原理,颜色补偿：采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时，都需要作颜色补偿。 带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换并放大。 通常干扰光占该染料所发
7、出荧光总量的X%,补偿模型图,鞘流系统 流动室,鞘液,鞘流原理 鞘流公式,Re= dv Re为雷诺（Reynolds）系数，d 为管道直径，v 为液体流速，密度为 ，黏滞系数为。 当Re2300时，液体处于稳流状态， 当Re 2300时，液体处于湍流状态。,数据处理分析转换,数据存储: LIST MODE,数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图（3D Plot）等,外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）,荧光信号,双色直接染色,数据分析,直方图分析,数据分析,点图分析,数据分
8、析,等高图和密度图分析,数据分析,三维图分析,当前生产流式细胞仪的公司,BD公司 贝克曼-库尔特公司 Cytomation公司 Bio-Rad 公司 Partec公司（德国） Applied Biosystems公司,BD公司简介,BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美国新泽西州,BD公司流式细胞仪产品,FACSCount流式细胞仪,FACSCalibur流式细胞仪,FACSCanto流式细胞仪,BD公司流式细胞仪产品,FACS Vantage SE-大型分选机,FACS Aria-高速分选的台式机,F
9、ACS Diva 高速分选的数字化大型机,贝克曼-库尔特公司流式细胞仪产品,FC 500 全自动分析仪,Gallios 双激光6色,EPICS ALTRA分析分选系统,AppliedBiosystems公司,AttuneTM 声波聚焦细胞分析仪,流式细胞仪的应用,细胞内和细胞外发生了什么事件？,流式细胞仪的应用领域,临床研究: 血液、肿瘤、药理、免疫. 生物学研究： 遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物、. 环境研究： 海洋生态研究. 制药工业 食品工业 农业畜牧业,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 细胞移植的交叉
10、配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病,流式细胞仪的临床免疫学应用,淋巴细胞免疫分型 淋巴细胞亚群分析 CD4绝对计数 HIV与SARS的诊断与研究 淋巴细胞CD4/CD8分析 CD4绝对计数 T细胞活化,细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 免疫功能和免疫调控的研究 淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究 淋巴细胞的增殖 树突状细胞的研究 HLA-B27检测,淋巴细胞亚群分析,淋巴细胞亚群分析,使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时对淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（CD分子）的表达进行分析，可以将淋巴细胞亚群区分开，并定性分析
11、； 淋巴细胞亚群的百分含量 淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析,临床意义,了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案 免疫系统疾病 免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能， 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,淋巴细胞亚群分析,
12、根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为 T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+） T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+） Th/Ts 评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击 Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE） Th/Ts降低：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血,常见疾病的T 淋巴细胞的变化：,疾病 CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 类风湿性关节炎 （活动期） 系统性红斑狼疮 - 或 （活动期） 多发性硬化症 重症肌无力 膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎 自
13、身溶血性贫血 上呼吸道感染 ,常见疾病的T 淋巴细胞的变化,CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 肿瘤 再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染 血小板减少 活动性特应性皮炎 过敏性皮炎 ,淋巴细胞亚群双色分析,12%,76%,49%,26%,11%,AIDS 病人T亚群分析,27-51%,15-44%,50-84%,先天性无 r 球蛋白血症,5-18%,乳腺癌患者T淋巴细胞亚群变化,TriTEST/MultiTest与T淋巴细胞绝对计数,使用三色试剂或四色免洗试剂 样本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL 免洗操作，减少细胞丢失 绝对计数TruCOUNT管预先加有已知数量微球，在流式细
14、胞仪上直接得到T淋巴细胞亚群的绝对含量，提高工作效率和计数的精确度单平台计数 MultiSET全自动淋巴细胞亚群软件进行样本获取和分析 MultiSET软件自动做质量检查，帮助发现样本运输、处理等过程中造成的错误 医生报告T淋巴细胞及TH、TS百分含量、绝对含量和H/S比值，并报告参考值范围,TriTEST CD4/CD8/CD3分析 与T淋巴细胞绝对计数,%T Lymph CD3+ Abs Cnt CD3+CD4+ %T Lymph CD3+CD4+ Abs Cnt CD3+CD8+ %T Lymph CD3+CD8+ Abs Cnt T H/S Ratio,MultiTEST CD3/CD
15、8/CD45/CD4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,HLA-B27分析,HLA-B27, HLA-B27是MHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达 HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，在其它血清阴性骨关节病、银屑病性关节炎、葡萄膜炎等也有明显表达 使用流式细胞仪，可以快速、灵敏、准确地分析HLA-B27 BD HLA-B27 Kit检测HLA-B27，报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/阳性结果。实验的灵敏度为100%，特异性为97.5%,HLA-B27,HLA-B27阴性样本,HLA-B27阳性样本,流式细胞术在临床血液学中的应用,流式细胞
16、仪的临床血液学应用,白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 网织红细胞的分析 阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）诊断 血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析 血小板自身抗体检测 网织血小板计数,白血病免疫分型,FAB分型：AL分为AML（M0-M7）& ALL 白血病的MICM分型 Morphology Immunology Cytogenetics Moleculor Genetics 白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MICM分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的
17、研究都具有重要作用。,白血病细胞特性：,白血病细胞的异常表现在抗原系列异常和时间异常 异常的抗原表达(Aberration Antigen Expression) 丧失系列规律性（lineage infidelity) 过高，过低，不表达， 交叉 丧失分化发育的阶段性（differentiation asynchrony) 早期与晚期抗原同表达,白血病免疫分型抗原,常用白血病细胞系列与分化阶段抗原,白血病细胞系列非特异性抗原： 干/祖细胞：CD34+、HLA-DR+、CD38- 原始细胞：CD34+、HLA-DR+、CD38+ 幼稚细胞：CD34-、HLA-DR-、CD38+）,白细胞共同抗原
18、：CD45,CD45-SSC的临床应用,CD45是白细胞的共同抗原成分。所有人类白细胞均表达CD45，包括淋巴细胞、单核细胞、多形核细胞、嗜酸、嗜碱性细胞、胸腺细胞、脾细胞、扁桃腺细胞以及骨髓前体细胞。造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高低紧密相关，即分化程度高的细胞CD45表达量高，分化程度低的细胞CD45表达量低（淋巴细胞单核细胞成熟粒细胞原幼细胞，在红细胞中不表达；SSC是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞单核细胞原幼细胞淋巴细胞）。目前，国际上采用CD45SSC设门（Gating），可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分型的准确性。,CD45的临床应用,
19、用CD45-SSC设门寻找异常细胞，将细胞分为5个群体，当幼稚细胞达70-80%时，即可大致估计AL的类型。骨髓成分复杂，各种大小和分化程度的细胞均有，若不用CD45-SSC设门，我们检测到的阳性细胞的百分率是以总细胞为分母来计算，当时以阳性细胞大于20%为界线，现在以CD45-SSC设门，排除了正常细胞的干扰，阳性细胞的百分率是以幼稚细胞为分母，因此再以阳性细胞20%作界线则不太合适了，所以，用CD45-SSC设门寻找异常细胞时，以定性比定量更重要。,正常人血液白细胞免疫表型散点图,正常人血液细胞免疫表型,T淋巴细胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+，部
20、分细胞CD（16+56）+，无CD4+CD8+双阳性细胞 B淋巴细胞：CD45+、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13- NK细胞：CD45+ 、CD（16+56）+/CD3- 单核细胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+ 中性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高 嗜酸性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高,正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图,正常人骨髓细胞免疫表型,淋巴细胞:CD45+、CD34-/CD38+
21、、CD5+/CD7+（T淋巴细胞）；CD10-/CD19（B淋巴细胞） 单核细胞:CD45+,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA- 粒系细胞: 原粒细胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+ 早幼粒细胞及其以下各阶段中性粒细胞：CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，与原粒细胞或更幼稚细胞的表型有明显差异 巨核细胞：CD45+、CD41+/CD61+ 幼红细胞：CD45-、CD36+/GlyA+,AML免疫表型,急性T淋巴细胞白血病（T-
22、ALL） 骨髓细胞免疫分型散点图,急性早幼粒细胞白血病（AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图,FCM在临床白血病分型中的作用,能正确区别AML和ALL，并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型 能正确鉴别AML中难于鉴别的M0、M6、M7 诊断双系或双表型白血病 发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病 诊断少见疑难白血病（如HCL）,免疫分型 对下列情况具有重要意义,用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。 形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。 混合性白血病。 部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒-单核细胞和单核细胞白血病
23、的鉴别尚有一定困难。 慢性淋巴细胞白血病。 微小残留白血病。,阵发性血红蛋白尿(PNH),阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血 患者体内红细胞呈不均一性 利用流式细胞术和CD55和CD59单克隆抗体，对PNH患者红细胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例,阵发性血红蛋白尿PNH,正常人红细胞、粒细胞和血小板CD59表达完全阳性 PNH患者血细胞分为三型： 型：CD59表达完全阳性，荧光强度与正常人阳性峰荧光强度接近 型：CD59表达部分阳性，荧光强度介于型与型之间 型：CD59表达完全阴性 分析P
24、NH患者各型细胞所占百分比，评估疾病的严重程度,红细胞 PNH分析,A 正常人 B D 病人,造血干细胞计数,造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细胞。 造血干细胞的特征是： 大小（FSC）和颗粒度（SSC）介于成熟淋巴细胞、大淋巴细胞相似 细胞内含有较多核酸物质 CD34表达弱阳性或强阳性 CD45表达弱阳性 在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数,造血干细胞计数,血小板检测,血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病 CD41-CD61复合物：血小板无力症 CD42a-CD42b 复合物：巨大血小板症 血小板活化的相关检查 血小板颗粒膜糖蛋白，如CD62，CD63 血小板膜糖蛋
25、白活化表位，如PAC-1 血小板减少性疾病 血小板自身抗体检测 网织血小板的检测 血小板脱落微粒的检测,血小板活化,IIb/IIIa复合物（CD41/CD61）在所有静止和活化的血小板上都有表达 血小板活化时发生的改变 IIb/IIIa复合物发生变构，表达PAC-1 血小板内颗粒释放，分泌促进凝血反应的物质，这时表达CD62P,CD61圈血小板门 PAC-1/1：阴性对照，静止的血小板 PAC-1/CD62P：试验管，ADP刺激下活化的血小板，报告血小板活化百分含量,血小板活化,脑栓塞病人血小板活化检测,A CD61-SSC设分析门 B 阴性对照 C 治疗前 PAC-I 27.74% CD62
26、P 15.86% D 溶栓后 PAC-I 9.13% CD62P 4.12%,血小板活化的意义,直接测量循环血小板活化状态与反应性 可直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板 血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成 心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关 预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性 缺血性脑血管病与血小板活化有关 子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加 抗血小板治疗疗效监测,血小板无力症（CD41缺陷，PAC-I下调）,蓝阴性对照 绿病人 红正常人,巨血小板症,蓝阴性对照 绿正常人 红病人 CD41表达上调 CD
27、42a/CD42b缺失,血小板自身抗体 ITP病人,流式细胞仪的科研应用,免疫功能研究 树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 血小板分析（心血管疾病） 环境微生物分析 分子生物学研究,Cytometric Beads Array CBA系统,简介,CBA：流式微球阵列又称液相多重蛋白定量技术，是指用一系列荧光强度不同的微球，将可溶性微粒进行捕获并检测的流式技术。每个CBA微球在FL3有特定的荧光强度，大小一致，包被有适用于特定分析（如其他抗体或可溶性蛋白）的特异性抗体，提供了类似ELISAs孔板的捕获表面。简而言之，将包被有不同抗体的微球混合在一个样本中即可进行多
28、参数检测。这种技术可大大节约样本用量，避免ELISAs分析时对样本过度稀释导致分析灵敏度的降低。,CBA原理,操作步骤,检测物与捕获微球共孵育; 洗涤; 标记荧光探测试剂（FITC或PE标记）; 洗涤; 流式细胞仪检测; CBA分析软件批量数据分析。,CBA分析软件,CBA技术,能够同时对单个样本进行多种检测。 较传统检测大大节省样本量。 与ELISAs相比灵敏度高、重复性好。 所有分析只需一组标准曲线。 避免酶联反应所致人工假象。 节省操作时间。 节省检测时间。,与传统的ELISAs检测相比,细胞凋亡,细胞膜分析-PS外翻（建议用于悬浮细胞） PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白Annexin-V可与PS结合,Annexin V Assay/PI能够区分死亡与凋亡,Thank you for your attention!,