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1、一、实验目的,1、继续学习微生物制片方法； 2、掌握芽孢、荚膜染色的基本原理及方法。,二、原理：,（一）芽孢染色 1、芽孢：某些细菌（多为革兰氏染色阳性杆菌）在一定生长阶段或环境条件下，细胞正常代谢、分裂停止，胞质浓缩，在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形，对不良环境有较强抵抗能力的特殊结构。由于在细胞内，也叫内生孢子（Endospore）。,2、芽孢菌体的特点：不能繁殖的休眠体，含水少、含脂高、致密不透明，对不良环境有很强的抵抗能力。 有的芽孢在一定条件下可保持活力数年甚至数十年之久。条件适宜时能重新萌发。 芽孢尤其能耐高温： 枯草杆菌的芽孢，在沸水中可存 活1小时； 破伤风芽孢杆菌可在沸水
2、中存活 3小时； 肉毒梭状芽孢杆菌的芽孢可在沸水 中存活6小时，即使在1800C干燥箱中仍可存活10分钟。 芽孢可作为培养基灭菌彻底与否的检验依据。,3、芽孢的大小、位置具有分类鉴定上的意义：,肉毒芽孢杆菌,能形成芽孢的细菌种类,在杆菌中能形成芽孢的种类较多，在球菌和螺旋菌中只有少数菌种可形成芽孢 产生芽孢的几个属： 芽孢杆菌属(Bacillus) 梭状芽孢杆菌属(Clostridium) 芽孢八叠球菌属(Sporosarcina),4、芽孢染色的原理： 利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。 细菌的芽孢壁比营养细胞的细胞壁厚，
3、致密、通透性低，着色和脱色都比营养细胞困难。,一般采用碱性染料（孔雀绿）并在微火上加热或延长染色时间，使菌体和芽孢同时都染上色后，再用水冲洗脱去菌体的染料，此时仍保留芽孢的着色，并用对照染料来染菌体，这样就将芽孢和菌体分别染成两种不同的颜色。,（二）荚膜染色法： 有些细菌生活在一定营养条件下，可向细胞壁表面分泌一层松散透明、疏松、柔软、粘度极大，粘液状或胶质状的物质即为荚膜（Capsule）。 荚膜的化学成分主要是多糖、多肽、蛋白质、脂以及由它们组成的复合物脂多糖、脂蛋白等。 荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加某些病原菌的致病能力
4、，抵御宿主吞噬细胞的吞噬。,荚膜染色原理：荚膜化学成分为多糖类衍生物、糖原或多肽，对染料结合力很弱，因此不易染色。一般采用负染色的方法，使细菌和背景着色，背景与菌体之间形成一透明区即荚膜。由于荚膜很薄，容易变形，在制片时一般不用加热固定。,肺炎球菌荚膜染色,钾细菌荚膜染色,三、材料：,1、菌种：枯草芽孢杆菌、钾细菌； 2、染色液：孔雀绿、蕃红溶液、甲醇、生理盐水等； 3、器材：试管夹、酒精灯、接种针、载玻片、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸等。,钾细菌(Bacillus mucilaginosus) 胶质芽孢杆菌,（一）芽孢染色 取枯草杆菌制成涂片、干燥、固定； 用试管夹夹住玻片一端，涂层上加孔雀绿3-4滴； 加热5分钟使冒蒸汽，中途补加孔雀绿，勿煮干； 冷却、水洗（细水）； 蕃红溶液复染2 - 3分钟，水洗； 干燥、镜检； 结果：芽孢呈绿色，菌体呈红色。,四、操作步骤：,（二）荚膜染色 取钾细菌一环，做成涂片，自然干燥（不能加热）， 可用吹风机冷风吹干； 甲醇固定； 水洗； 蕃红溶液12分钟； 水洗； 自然干燥、镜检； 结果：背景红色、荚膜无色、菌体红色。,五、绘图： 绘出芽孢染色、荚膜染色的结果,