最新6007细菌及病毒的遗传作图11-PPT文档.ppt

《最新6007细菌及病毒的遗传作图11-PPT文档.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《最新6007细菌及病毒的遗传作图11-PPT文档.ppt（126页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、,内 容,一、病毒的一般特性及类型 二、噬菌体的染色体作图 三、细菌的细胞和染色体结构 四、细菌的染色体作图,第一节 病毒的一般特性及类型,病毒的一般特性 病毒的类型 噬菌体的生活周期,一、病毒的一般特性, 形体极微小，只有在电子显微镜下才能观察到； 化学组成简单，主要是核酸和蛋白质； 只含一种核酸（DNA或RNA）； 无细胞结构，为蛋白质外壳包裹核而成的颗粒； 缺乏独立代谢能力； 繁殖方式独特，只能依赖宿主活细胞的代谢机器， 通过核酸复制和蛋白质合成后再装配成完整的病毒 颗粒的方式进行繁殖； 具有双重存在方式，或营专性寄生在活细胞内，或 在细胞外以大分子颗粒状态进行传播； 对干扰素敏感，而对

2、抗生素不敏感,病毒大小,二、病毒的类型,依据宿主范围 植物病毒 动物病毒（人、脊椎动物、昆虫） 微生物病毒（真菌、藻类、原生动物、 细菌、放线菌、蓝细菌） 噬菌体感染细菌和放线菌的病毒。 依据遗传物质：DNA病毒、RNA病毒,微生物病毒噬菌体,噬菌体的特点,个体极小：只能借助电镜才可看见，但在实验时一般用肉眼观察它感染细菌后所形成的噬菌斑加以识别。,专性寄生：在活体外不具任何生命特征，往往一个噬菌体只感染一种细菌。侵染过程： 吸附 遗传物质注入 复制 裂解细菌,无细胞结构：化学组成和繁殖方式简单。,不同结构的噬菌体（或不同的突变型）可同时感染一个细菌，并能在细菌细胞内进行基因重组，即混合感染。

3、,微生物病毒噬菌体,尾管,刺突,T4由头部、颈部、尾部组成,植物病毒,动物病毒,病毒的多样化形态和大小,HIV病毒（反转录病毒）,RNA病毒,刺突tail pins,Phaga, bacterioohaga,95nm,95nm,head,neck,tail（24环）,尾丝(tail fibers),65nm,噬菌体,噬菌体,烈性噬菌体,三、噬菌体的生活周期,当噬菌体感染细菌后，寄主细胞的DNA立即停止活动，由噬菌体的DNA指导合成噬菌体的DNA和蛋白质，产生新的子噬菌体，最后寄主细菌裂解，释放出成熟的子噬菌体，这一类噬菌体称之为烈性噬菌体。通过它对相邻细菌连续不断地侵染和裂解，在长满细菌的不透

4、明的菌落上看到一个圆形的透明区噬菌斑。,噬菌体的增殖包括 吸附 侵入 核酸复制与蛋白质合成 装配 释放,烈性噬菌体的侵染过程,噬菌斑,温和噬菌体,当噬菌体感染细菌后，噬菌体的DNA在宿主细菌体内不立即复制，而只是潜伏宿主细菌体内，与宿主细菌“共存”，并不将主细菌裂解，这一类噬菌体称为温和噬菌体。,温和噬菌体的主要三种繁殖方式：,与烈性噬菌体相似，在宿主细菌体产生很多子代噬菌体，使宿主细菌裂解，这种情况只是偶然或是通过诱导才发生。 当噬菌体的DNA进入宿主细菌体内后，插入到宿主细菌主染色体DNA中，随着宿主细菌主染色体DNA复制而同步复制。与宿主细菌主染色体DNA结合在一起的噬菌体称为原噬菌体，

5、而携带原噬菌体的细菌叫溶源性细菌。 当噬菌体DNA进入宿主细菌体内后，独立于宿细菌DNA之外，以质粒的形式存在于宿主细菌的胞质中。,某些温和噬菌体在侵染细菌后，其DNA整合到 宿主细菌染色体中。这种处于整合状态的噬 菌体DNA称为原噬菌体。 含有原噬菌体的细胞称为溶原性细菌或溶原体。 原噬菌体不进行DNA复制和蛋白质合成，而是随 着宿主细菌染色体的复制而同步复制，并且，随 着宿主细胞分裂而平均分配到两个子细胞中去， 代代相传，这样便进入溶原周期。,型裂解途径,P1型裂解途径,温和噬菌体的生活周期,噬菌体和表型与噬菌体遗传学 基因的细微结构作图 缺失作图 互补测验和顺反测验 负干扰,第二节 噬菌

6、体的染色体作图,一、噬菌体和表型与噬菌体遗传学,寄主范围突变型（h）： 由于基因突变能感染两个品系细菌的突变型，野生为 h， h只能裂解野生型的大肠杆菌，h能裂解野生型及抗 性型的细菌。把两者和大量的野生型和抗性型细菌混合接 种，经培养后就可看到两种噬菌斑，透明的是h，半透明的 是h。,快速溶菌突变型（r）： 由于基因突变能更快复制并裂解细菌的噬菌体突变，野生型为r，由r 于裂解细菌的速度比r快，所以在同一时间内感染同一细菌时， r形成的噬菌斑小，r 形成的噬菌斑大，而且边缘清晰。,条件致死突变型： 在某种条件下可生存，在另一条件下不能生存的突变 型。如温度敏感突变（ts）；在25时能生长，4

7、2时不 能生长，色氨酸需要型（c）必须在环境中有色氨酸才能生 存；小噬菌斑型（m）；混浊噬菌斑（tu）等都可依据菌斑 形状鉴别。,两种不同的T2突变体进行杂交,两种不同的T2突变体进行杂交,二、基因的细微结构作图,T4噬菌体的rII系统 r型突变体：快速溶菌突变体（rapid lysis）Benzer选择rII突变体作研究的优点是：与野生型rII+ 相比具有不同的宿主范围。rII不能在E.coli K上生长提供了一种选择手段。,T4 rII 突变体和rII+在E.coil上的表型,T4 E.coil B E.coil K（） rII 大而清晰园 + rII+ 小而模糊 + + 小而模糊,E.c

8、oil B能使rII突变体生长，称为rII的许可性宿主（Permisive host），E.coli K（）不能使rII突变体生长，称为rII的非许可性宿主（Nonpermisive host）。,用两种不同的rII突变体感染同一细菌E.coli B，一旦 进入细胞，T4之间的DNA就发生重组，从而产生重组类型的噬菌体。然后感染E.coli K，野生型重组体的数目等于在K上的pfu/ml的数（Plague forming Unit） 优点：用rII系统和两个宿主，不需要筛选大量的噬菌斑就能选择到极少发生的重组体。,用两个不同突变体的噬菌裂解液加到E.coli B株的肉汤培养液中，当二个突变类型

9、的DNA感染同一细菌时可发生杂交。大多数复制的DNA是原来的类型，有时也能重组产生一种双重突变型和正常的重组体（即野生型）。杂交后代植到E.coli B上后，都能良好生长，而植于E.coli K时，只有重组野生型才能生长，双突变体重组型不能生长。,两个不同突变的噬菌体DNA重组的过程,Mix the two phages,Coinfect E.coli B,A,A,r103,r104,Wild type,Double mutant phage,Take some of the phage preparation,dilute it(10-8), and infect E.coli B,Take

10、 some of the phage preparation,dilute it(10-3 ), and infect E.coli K,Plate the cells and observe the number of plaques.,Total number of phages,Wild type phages produced by intragenic recombination,两个不同突变的噬菌 体DNA重组的过程,将8个独立而来的rII突变体成对感染E.coli B。形成噬菌斑后再将其裂解液接种感染E.coli K，只有野生型重组体rII 才能生长，而双重组型（rIIrII）不

11、能捡出，也不能生长。因此计算重组体的方法是以野生型的数2。 公式如下：,基因内重组 Intragenic Recombination,2rII+ 噬菌体数,总 噬 菌 斑 数,2在K上生长的噬菌体数,在B上的噬菌斑数,100%,重组率=,E.coli B,rII ,rII ”,植于E.coli K上选择,T4 rII位点基因内重组的选择。rII不能在K上生长，当二个带有rII不同等位基因的T4感染同一B株后，其某些后代能在K上生长，即已成为rII，结果说明在一个基 因内发生了重组，而不是在基因间。,根据重组率所得基因图： rII1 rII7 rII4 rII5 rII2 rII8 rII3 r

12、II6 _|_|_|_|_|_|_|_|_ 它们的图距就是rII+的重组率,rII基因内重组说明，基因是可以分割重组的，它由更小的单位组成，Benzer称其为重组子recon，重组可以发生在重组子之间，但不能发生在其内部。因此，重组子(而不是基因)是重组的单位，基因是重组子完整的线性顺序，一对核苷酸是重组的最小单位。,缺失作图 deletion mapping,缺 失 区,有一特殊突变体D1，当它分别与带有突变点1、2、3、4、5、6、7或8的突变体杂交时不能获得rII+重组体，那么D1就是缺失18位点的突变体： 9 10 11 12,Benzer利用在rII区域中含有短的缺失的特殊突变体来定

13、位其它新的突变位点。 原理：假定一个由12个突变位点组成的基因图： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,有另一突变体D2，当它与5、6、7、8、9、10、11或12突变位点的突变体杂交时不能获得rII+重组体。即D2就是缺失512的突变体 根据重叠缺失区，可将基因分成三个区域 I II III D1 D2,1 2 3 4,缺 失 区,如何定位新的突变位点 当与D1杂交能获得rII+重组体，与D2杂交却不能， 该突变体的突变位点位于III区； 当与D2杂交时能够，但与D1杂交时不能获得rII+重 组体，该突变位于I区； 与D1和D2杂交都不能得到rII+重组体，其突变位点 位于

14、II区。,在III区里的一个突变体与D1杂交获得rII+的情形,I 和II缺失区,I和II区,D1,新突变体,+,+,+,+,+,III区, , ,突变位点,III区,缺失突变体之间也可以杂交从而象点突变那 样定位，如果杂交得不到rII+重组体，那缺 失区就是重叠的。例如有一缺失图：,1,2,3,利用上述缺失图可将新的突变定位 思考：下图表示T4 rII A顺反子中4个缺失突变体的缺失图 1 2 3 4 现有在rII A中4个点突变体ad，分别试验它们与4种缺失突变体杂交获得rII+的能力，结果如上表。 问：4种点突变的顺序怎样排列？,a b c d 1 + + + + 2 + + + 3 +

15、 + 4 + ,三、互补测验和顺反测验,当不能单独在K菌株上生长的两个rII突变体混合感染时，它们能象野生型噬菌体那样在K株上生长，这样两种突变型称为互补的突变型，因为每一种能补偿另一种功能。使两者都能生长。（T4染色体在宿主细胞中暂时二倍化）,噬菌体T4的互补作用,不同的rII突变体可以分成两类：即A组和B组。A组中的所有突变体能与B组中的所有突变体互补，而A组中的某一突变体不能与该组中的另一突变体互补，同样B组中的某一突变体也不能与该组中另一突变体互补。A组中的所有突变体能定位到rII区段的一边，B组中的所有突变体能定位到rII区段的另一边上,A组 B组,A互补群,B互补群,混合感染,rI

16、I突变体,rII突变体,E .coli k(),互补作用 无互补作用 细胞裂解释放 细胞不裂解无子 出子代噬菌体 代噬菌体释放,rII互补作用图解：两个不同的突变体rII和rII同时感染E.coli K，一般情况下，rII突变体不会裂解K产生子代噬菌体；然而当两个rII能互补时，就会裂解并有噬菌体生长，如果两个突变体不能互补，就不会裂解，也不会有噬菌体生长。,rII突变体互补的解释： rIIA rIIB rII1 （1） （2） 裂解 有两个基因rIIA和rIIB在细菌裂解中起作用，裂解的两个步骤分别由rIIA基因产生的酶A和rIIB基因产生的酶B控制。两个rII突变体分别在rIIA或rIIB

17、区域缺陷,+,rIIA,rIIB,+,rII,酶A,酶B,由于rII1和rII2的染色体各自能产生裂解途径中所必需的一种酶,所以裂解就能发生,即有野生型表型出现，称这两个rII突变体能互补 与二倍体植物细胞染色体互补作用相类似，T4噬菌体的混合感染使噬菌体染色体处于暂时的“二倍体”细胞状况，在这过程中发生了互补作用。,顺反子（Cistron）,不能互补的突变必然影响的是同一功能单位，能够互补的突变必定影响不同的功能单位，通过顺反试验发现的遗传功能单位称为顺反子。rII区段中包括两个作用单位A和B。也就是两个顺反子。,顺反子的概念来自顺反试验：它是用于说明在同一染色体上（顺式）或相对染色体上（反

18、式）排列的突变位点之间的互补试验。顺式试验实际是对照，反式试验才是真正的互补试验。如果反式排列时有互补作用，说明两个突变位点处于不同的顺反子中，如不能互补，说明它们属于同一顺反子。,顺式试验,反式试验,突变位点位于同一顺反子中,突变位点于不同顺反子中,A,B,A,B,A,B,A,B,+ ,+ +,一个顺反子是一段遗传区域，在这一遗传区域中的突变位点之间没有互补作用。例如两个不同的rII突变体（反式结构）感染同一细菌，而噬菌体不能生长，那么这两个突变位于同一顺反子中（右上）；如果有互补作用，即后代噬菌体能生长，那么这两个突变体位于不同的顺反子中（右下），在右上图中，只有顺反子B的功能正常，而在右

19、下图中，A、B两个顺反子的功能都正常。,Benzer 顺反子概念和基因内重组 Discovery of Recombination Within the Gene,Benzer 以T4噬菌体为材料进行了研究工作 ，正式提出“顺反子”这个术语,Benzer 顺反子概念和基因内重组 Discovery of Recombination Within the Gene,Benzer将两个rIIA突变型对B株进行混合感染，再让释放的子代噬菌体感染K株。 出现了野生型噬菌体。,四、负干扰,在噬菌体的三点测验中，发现一个单 交换发生后，会增加另一个单交换发生 的概率即所谓负干扰现象，这时干扰系 数为负值，

20、或符合系数大于1 负干扰系数后来在真核生物如家蚕、真 菌中也有发现，负干扰的发生可能与基 因转变有关，往往重组基因相距很近或 发生基因内重组时会出现负干扰,第三节 细菌的细胞和染色体结构,细菌细胞 细菌染色体 细菌遗传研究的方法 细菌的突变型,一、细菌细胞 大小：1-2 m； 繁殖方式：二裂式均等分裂，1代/20min。,大肠杆菌 E.coli,细菌的基本形态,细菌的结构模式图,二、细菌染色体 结构:环状双链DNA，单倍性，以折叠或螺旋状态存在； 大小：长约250-35000m(未螺旋)； 复制方式：着膜式复制。 分裂特点：均等分裂，无基因重组。,E.Coli 的拟核,三、细菌遗传研究的方法,

21、基本培养基（minimal medium） 完全培养基（complete medium）,细菌的平板培养,细菌的稀释培养及菌落,影印培养法,四、细菌的突变型,合成代谢功能的突变型:（营养缺陷型） 分解代谢功能的突变型： 抗药性突变型: 青霉素: penr, pens 链霉素: strr, strs,penicillin Streptomycin 抗性: resistance 敏感: sensitive,抗噬菌体突变型 T1噬菌体 Tonr Tons T2噬菌体 Ttor Ttos,突变型的筛选,例如： 营养缺陷型的筛选: u.v 野生型细菌 完全培养基： 影印培养 基本培养基： 补充培养基 ：

22、 氨基酸类 维生素类 系列氨基酸 补充培养基：赖氨酸 脯氨酸 精氨酸.,接合 转化 性导 转导与细菌染色体作图,第四节 细菌的染色体作图,一、接合,接合现象的发现,1946年Lederberg和Tatum用E.coli K12品系中两个菌株A和B做了一个 杂交实验首先证明了E.coli的有性生殖和基因重组。,A：methiothrleuthi 甲硫氨酸、生物素、 B：methiothrleuthi 苏氨酸、色氨酸、硫胺素,A与B在基本培养基上都不能生长，A+B混合培养在完全培养基上过夜，然后把混合物离心、洗去培养基，涂布在基本培养基上，长出了菌落，是野生型。,黎德伯格和塔特姆的接合(杂交),推

23、测 有四 种可 能：,1、营养上的互补,2、A与B发生杂交,3、一个菌株的突变型基因发生了回复突变,4、细菌细胞没有接合，而是交换了DNA,1950年，Davis设计了U形管代谢产物互补实验，证明了A与B是通过接合传递遗传物质的。细菌之间通过杂交，发生了基因的重组和交换。,说明什么?,Met+bio+thr+leu+,在任何一臂内都没有出现原养型细菌。这说明两个菌株间的直接接触-接合，是原养型细胞出现的必要条件。,Hayes（1952)试验证明，在接合过程中遗传物质的交换是一种单向的转移： 供体（雄性） 受体（雌性）,Heyes实验,methiothrleuthi methiothrleuth

24、i,A菌株,B菌株,基本培养基上有菌落出现,（2）链霉素处理A再与B杂交，在基本培养基上有菌落出现,（3）链霉素处理B再与A杂交，在基本培养基上无菌落出现。,说明：遗传物质在大肠杆菌中的传递不是相互的，在这里，A为供体可将遗传物质传递给B（受体），B不能将遗传物质传递给A。后来发现，供体与受体间性行为的不同，是由一个微小的可转移的质粒F因子引起的。,（1）,两个E.Coli 细胞杂交的电子显微镜照片(X 34,300),性伞毛/接合管,性伞毛/接合管,F因子及F+/Hfr向F的转移,Hayes和Cavalli-Sforza（1953)发现，供体有一个性因子即致育因子-F因子，由DNA组成，是染

25、色体外的遗传物质。其组成：,F 因子：致育因子（性因子） 携带F因子的菌株称为供体菌或雄性，用F表示。 未携带F因子的菌株为受体菌或雌性，用F表示。 F 因子的组成： 复制区 (含2个复制起点oriT,oriV)； 致育基因区； 配对区（含有4个IS）,E.coliF因子存在状态有三种类型： 没有F因子，即F 游离状态的F因子，即F+ 整合的F因子，即Hfr,F因子的转移,F+F-的特点,F因子转移的频率高，1/10，使F-F+。 染色体重组频率低；10-6 。 F+F+不发生接合。 因此，F+品系又称为低频重组品系 (low frequency recombination，Lfr)。,F+F

26、-,F+ F+,F- F+,高频重组 (Hfr),Hfr的形成及转移过程 由F因子和细菌染色体的单交换产生； 转移时带有供体细菌的染色体。,Hfr的特点 ： 染色体重组频率高，比 F+F- 高1000倍； F因子转移频率低， F-F+ 很少或没有。 Hfr和F+的联系和区别 联系： 都是雄性菌，含有F质粒 区别： 前者高频重组，后者低频重组； 前者F因子转移频率低，后者F因子转移频率高； 前者F因子整合，后者F因子游离。,中断杂交实验绘图,为了证明接合时遗传物质从供体到受体细胞的转移是直线式进行的，Jacob和Wollman在五十年代设计了一个著名的中断杂交试验,1961年 Jacob 和 W

27、ollman 供体HfrH ：strs thrleuazir tonr lac gal 受体F ：strr thrleuazis tons lacgal 操作方法：37混合培养 每隔一段时间取样 搅拌器中断杂交 涂布含链霉素的基本筛选培养基 影印培养于含链霉素的几种不同的培养基（选择培养基）上 观察重组子 鉴定各基因的转移时间,HfrH菌株各非选择标记基因进入F细菌的时间和频率,以基因出现的时间为标准，作出E. coli的遗传连锁图,用中断杂交法确定的几个Hfr菌株的基因顺序,结论：不同Hfr菌株向F细胞转移的顺序、起点和方向不同。表明大肠杆菌的染色体是环状的。,大肠杆菌的环状染色图,细菌重组

28、的特点： 基因重组发生在部分二倍体中； 只有偶数次交换才能产生平衡的重组子； 在选择培养基上只出现一种重组子，而没 有相反的重组子。,例如：根据中断杂交试验已知 lac 和 ade 基因是紧密连锁的，而且 lac 比 ade 先进入受体。,未重组的基因型是lac+ade+ 重组体的基因型是lac-ade+,lac-ade间的距离：,转化：某些细菌(或其他生物)通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，并将此外源DNA片段通过重组整合到自己染色体组的过程,二、转化,转化的类型 自然转化（natural transformation） 细菌能够自然地吸收DNA，如枯草杆菌的转化。 工程转化（engin

29、eered transformation） 通过某种处理使细菌能够摄入外源DNA，如大肠杆菌 的转化。 转化效率：约1 转化片段的长度：20kb,细菌转化过程示意图,转化在基因定位中的应用,判断两个基因的位置关系 观察DNA浓度降低时AB基因共转化频率的下降和A、B各自转化频率下降的程度： 程度相同表明 ；共转化频率下降的程度远大于各自转化频率下降的程度，表明 。 观察转化频率： AB共转化频率与A、B各自转化的频率相近，表明 ；相差很远，表明 。 基因作图：判断基因间的距离,连锁,不连锁,连锁,不连锁,计算重组值,遗传作图,三、性导,F因子：从Hfr染色体上不精确分离产生的含有细菌基因组的

30、新的F因子。 性导：利用F因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体 的过程。内基因子和外基因子,雅科和阿代尔伯格发现：特殊的Hfr菌株能把lac+ 等位基因高频率地转移到Flac-受体中,lac基因位于远端，中断杂交实验中只有1/1000重组率,由F携带lac+ 基因进入受体后可在lac位点上形成部分二倍体Flac+ / lac-,四、转导与细菌染色体作图,转导：指以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程 Lederberg和Zinder（1951)首先在鼠伤寒沙门氏菌中发现转导现象 phetrptryr methis 在基本培养基上发现原养型的菌落 可能性：（1）接合 （2）转化 （3

31、） ？,转导类型： 普遍性转导：通过噬菌体可以转移细菌染色体上的任何基因，如P22，P1。 局限性转导：噬菌体只能转移细菌染色体的特定部分，如噬菌体。,U型管试验 将上述两种菌株分别放在戴维斯U型管 的两臂内，中间用玻璃滤板隔开，以 防止细胞直接接触，但允许比细菌小的物质通过，获得了野生型重组体，说明不是接合,普遍性转导的过程,普遍性转导作图, 原理： 如果两个基因始终一起转导或同时转导频率较高，那么表明这两个基因是连锁的； 两个基因同时转导的现象称为共转导或并发转导（contransduction）； 两基因共转导频率愈高，表明两个基因连锁愈紧密；相反，共转导频率愈低，则表明两个基因距离愈远

32、。,判断细菌基因间的位置关系 以普遍性转导噬菌体P1为例，测定大肠杆菌的leu、thr、azi三个基因的顺序。 供体 thr+ leu+ azir 受体thr- leu- azis，观察其共转导率。,三个基因间的排列顺序, 重组值的计算 a+b+供体 ab受体,局限性转导,(1)产生机制,(2)低频转导 由于不正常环化现象发生的频率较低，在释放出的106个噬菌体中只有1个gal转导噬菌体感染受体，因此转导的频率很低，称为低频转导。 dgal gal受体 稳定转导子 不稳定：整合切离,(3)高频转导(high frequency trasduction，HFT) 由于产生/dgal双重溶源菌，使溶菌物中既含有大量的dgal，又包含正常的噬菌体，正常的起了辅助缺陷型噬菌体成熟的作用，所以称为辅助噬菌体，从而导致高频转导。,1、为什么不少生物学家认为病毒不是生物？为什么病毒在遗传学研究中具有重要作用？ 2、名词解释：着丝粒作图、质粒、F因子、F+菌株、F-菌株、Hfr菌株、性导、列性噬菌体、温和噬菌体、原噬菌体、溶源性细菌、转导、普遍性转导、局限性转导,复习题7,