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1、病理学技术,病理技术是病理学的一个重要分支，是病理学研究中的方法学，是病理诊断的基础。 常规病理是病理技术最重要的部分，任何病理诊断离不开它。,病理学技术,分类： 常规病理（HE染色） 特殊染色（三色法、银染、糖原染色等） 免疫组化 细胞制片 分子诊断技术 电镜技术,重点介绍： 常规病理：原理、操作步骤、质量控制。,病理学技术,第一部分,原理及操作步骤,病理学技术,固定 fixation,脱水 dehydration,染色 staining,包埋 embedding,切片 sectioning,病理技术工作环节,封片 Coverslipping,病理学技术,固定（fixation） ： 概念:
2、 用甲醛等化学试剂对标本进行浸泡处理，使组织和细胞保持与离体前相仿。,病理学技术,固定（fixation） ： 目的: 保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。 保持细胞内特殊成分与生活状态时相仿，如细胞内一些蛋白质可以沉淀和凝固，使其定位于原位，有利于后期定位。 组织中不同物质固定后，产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。,病理学技术,固定（fixation） ： 目的: 硬化作用能使柔软组织（如脑）的质地变硬而易于操作。 固定能使细胞正常的半液体状（溶胶）变为不能逆转的固体状（凝胶）粘度。 ,病理学技术,固定（fixation） ： 操作方法: 临床科室切取的标
3、本置放于含固定液的容器中固定，送检病理科。固定液体积为标本体积的4-5倍。病理科收到标本后取材，上脱水机。,病理学技术,固定（fixation） ： 注意事项: 常规固定液为10%中性福尔马林液。 小标本的固定时间为46小时，大标本为1824小时或更久。,渗透力强 固定均匀 对标本影响小,病理学技术,常用的固定液：4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液 甲醛（40%）5000ml 磷酸氢二钠182.5g 磷酸二氢钠13.5g 氯化钠380g 蒸馏水45000ml 此液固定效果比单纯10福尔马林要好,病理学技术,脱水（dehydration） ： 目的: 用脱水剂完全除去组织内的水分，为下一步
4、透明及浸蜡创造条件。 还可以使组织再次发生一定的硬化。 脱水剂必须是与水在任何比例下均能混合的液体。,病理学技术,脱水（dehydration） ： 原理: 用不同浓度的乙醇将组织中的水分替换出来。,病理学技术,脱水（dehydration） ： 原理: 再用纯二甲苯将组织中的乙醇成分替换出来。-透明 用已经融化了的石蜡将组织中二甲苯成分替换出来。-浸蜡,病理学技术,脱水（dehydration） ：操作步骤,病理学技术,脱水（dehydration） ：,并不是所有标本都适用于这个脱水程序！ 标本的大小及性质决定了脱水时间！ 特殊标本在脱水之前要特殊处理！（如脱钙）,脱水的质量控制： 1、脱
5、水试剂定期更换 2、石蜡定期更换 3、脱水机保养 4、适用于本实验室的脱水程序,脱水机试剂的更换方法,每天更换一次,每周更换一次,每周更换一次,每周更换一次,每周更换一次,每周更换一次,更换的试 剂向后移,更换的试 剂向后移,更换的试 剂向后移,更换的试 剂向后移,病理学技术,脱水（dehydration） ：脱水机,病理学技术,组织切片技术(按包埋方法分) 明胶包埋法 火棉胶包埋法 碳蜡包埋法 塑料包埋法 冰冻切片法 石蜡包埋法 最常用的方法是石蜡包埋法。,4、包埋,石蜡包埋法： 利用石蜡的硬度，以石蜡包埋组织，制成石蜡切片。,在组织学实验室，一般使用两种石蜡：一种是55石蜡，用于脱水程序中
6、的石蜡浸泡。一种是60石蜡，用于石蜡包埋，制成石蜡切片。,病理学技术,包埋（embedding） ： 目的及原理: 将脱水浸蜡好的标本按一定规律放在大小不等的包埋模具里，加已经溶解的石蜡固定好，冷却。以便于下一步的切片制作。,病理学技术,包埋（embedding） ： 目的及原理: 脱水机和包埋机里的蜡都是经过加热溶解的，温度在60左右，呈液态。将组织放在包埋模里，加蜡填充后冷却，呈固态。有利于切片。,包埋的步骤,首先从包埋机中把熔化的石蜡注入合适包埋模具中（包埋模具分大、中、小三种）； 用加温预热好的眼科镊子将已经过浸蜡的组织块按一定原则（见包埋注意事项 ）放入包埋模具底面的中央处，再将包埋
7、模具移到冷冻台冷冻片刻。 立即将与组织块相应病理号的脱水盒放于包埋模具上，并从上面注入足够的石蜡，将包埋模具连同脱水盒一起移至包埋机的冷冻台； 待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移到冰块上加速凝固； 从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块（简称蜡块），待放冰箱准备切片。,病理学技术,包埋（embedding） ：,病理学技术,包埋（embedding） ：,病理学技术,切片（sectioning） ： 目的及原理: 将包埋好的组织块用切片机切成一定的厚度，一般切成46m。淋巴组织丰富的标本如淋巴结、鼻咽组织等应尽量薄切。,病理学技术,切片（sectioning） ： 目的及原理: 常用的切片机有轮
8、转式、平推式的。用轮转式的易于切出连续切片。切片厚度随制片目的而调整。,病理学技术,切片（sectioning） ： 操作步骤:,科室现有的几种切片机,病理学技术,染色（staining） ： 目的及原理: 借助于一种或多种染料，使组织和细胞内结构分别着不同的染色，这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构。 常规染色（HE染色）是目前运用最广泛的染色之一。此外还有如：VG染色、Masson染色、PAS染色属于特染范围。,病理学技术,染色（staining） ： 目的及原理: HE染色：包含苏木素和伊红两种染料。苏木素染细胞核，伊红染细胞浆。,病理学技术,染色（staining） ： 目的及原理:
9、 原理包括物理和化学的作用。 一般认为细胞核带负电荷，呈酸性，易与带正电荷的苏木素碱性染料结合而形成蓝色；细胞浆内主要的成分是带正电荷蛋白质，易与带负电荷的伊红染色结合染成红色。,病理学技术,染色（staining） ： 细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。,病理学技术,脱蜡 1、二甲苯（AR） 5分钟 2、二甲苯（AR） 5分钟 3、100%酒精（AR、无水乙醇） 1分钟 4、100%酒精（AR、无水乙醇）
10、 1分钟 5、95%酒精（工业酒精或医用酒精） 1分钟 6、80%酒精（工业酒精或医用酒精） 1分钟 7、自来水浸洗 1分钟 染色 1、苏木素染液 6分钟 2、水冼 1分钟 3、0.5-1%盐酸酒精分化 片刻（上下三次、颜色由蓝变红） 4、自来水冲冼 15分钟以上 5、0.5%伊红浸染 12分钟 6、水洗 1分钟 脱水、透明、封固 95%酒精 1分钟 95%酒精 1分钟 100%酒精 1分钟 100%酒精 1分钟 石炭酸二甲苯(1:5) 10秒钟 二甲苯 透明 1分钟 二甲苯 透明 1分钟 二甲苯 透明 1分钟 染色结果： 核：蓝黑色 胞浆：不同程度的粉红色 肌纤维：较深的粉红色 胶元纤维：淡
11、红色 红细胞：桔红色。,操作步骤,染色注意事项,二甲苯脱蜡时间冬季长些，夏季可短些，为防止脱蜡不净影响染色，脱蜡时间宁长勿短。 盐酸酒精分化时间灵活掌握，可以在切片蓝化后镜下观察。 染色后的脱水透明也很重要，若脱水不完全，切片会模糊不清，脱水的乙醇要保持纯度，切片在进入脱水乙醇前尽量把水份去掉。 HE染色虽是常规染色，但是要制出一张完美的HE切片并不是易事，需要实际操作人员在染色过程中认真控制。在染色的每一步骤都应仔细观察片子的情况，如在染了苏木素并分化后，就可以在显微镜下观察细胞核的着色情况，在其它的步骤中，也可以用肉眼或镜下作仔细观察。,染色常见问题及排除,病理学技术,封片（ Covers
12、lipping ） ： 目的及原理: 将组织切片封固保存于载玻片与盖玻片之间，使之不与空气发生接触，防止其氧化、褪色，利于镜检观察及保存。通常使用中性树胶封片。,病理学技术,封片（ Coverslipping ） ： 目的及原理: 中性树胶为浅黄色油状液体，透明度高，折光率近似玻璃，并呈中性，溶于二甲苯，不溶于水，可使切片标本封藏后观察得更为清晰，长期保存不褪色。,病理学技术,封片（ Coverslipping ） ： 操作步骤:,病理学技术,阅片,第二部分,质量控制,病理学技术,脱水,包埋,染色,切片,病理技术环节的质量控制,病理学技术,质量控制（ quality control） ： 标本
13、处理和保存原则: 1、新鲜标本立即投入固定液中固定。 2、常规固定液为10%福尔马林液。 3、固定液的量应充分，一般应为标本体积的 4-5倍 4、切取的组织块大小约为1.5x1.5mm2，厚度约为3mm。过大或过厚则会影响组织处理。,病理学技术,质量控制（ quality control） ： 脱水的质量控制: 1、脱水试剂定期更换 2、石蜡定期更换 3、脱水机保养 4、适用于本实验室的脱水程序,病理学技术,质量控制（ quality control） ： 包埋的质量控制： 1、按正确的程序包埋 2、防止交叉污染 3、防止组织混淆,病理学技术,质量控制（ quality control） ： 切片的质量控制： 1、组织面要切全 2、厚薄适中 3、切片平整，避免皱折 4、注意换刀，避免有刀痕 5、捞片时防止污染 6、贴片位置合适、美观,病理学技术,图例,病理学技术,总结： 制作一张高质量的病理切片的影响因素： 1、技术人员的技术能力与责任心 2、组织前期处理：固定、脱水等因素 3、取材的质量,病理学技术,提问环节： 问题： 1. 常用的固定液是？ 2. 脱水用的试剂一般有？它们之间的关系？ 3. 切片的厚度一般为？ 4. 最常用的是什么染色？是哪两种染料组成的？染色后结果是？ 5. 怎样判断一张切片是否优秀？,祝： 健康 快乐！,Thank you!,