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1、第一节 病毒的培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养 病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感 动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体 细胞进行分离培养（细胞培养）。 动物接种：接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。 按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜 神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯 疱疹病毒接种于家兔角膜。 鸡胚接种：一种比较经济简便的方法。 一般采用孵化9-12天的鸡胚，按病毒种类不同 接种于鸡胚的不同部位。 可采用绒毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔接种。 人或动物细胞在一定条件下可在实验室的培养瓶内生长。 优点： n每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等 n无个体差异
2、，准确性和重复性好 n可严格执行无菌操作 n细胞培养本身就能显示病毒的生长特征 n应用空斑技术可进行病毒的克隆化 细胞培养 n原代细胞（primary cell） 动物组织经胰蛋白酶消化 处理，使细胞分散而得到的细胞。 n二倍体细胞株（diploid cell strain） 将长成单层的 原代细胞消化分散成单个细胞，继续培养传代，其染色体 数与原代细胞一样，保持其二倍染色体数目的细胞，称为 二倍体细胞。 n传代细胞系（established cell line）能在体外持续 增殖传代的细胞，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而成 。 （一）细胞的类型 （二）细胞培养的方法 1. 静置培养（sta
3、tionary culture） 实验室 常用。细胞悬液装瓶，5%CO2温箱静置培养， 细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单 层。 2. 旋转培养（roller culture） 大规模生产疫 苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转， 细胞帖附于玻瓶四周，长成单层。 悬浮培养（suspensive culture） 通过搅拌使细胞处 于悬浮状态，并补充营养和校正pH，使之生长或维持存 活。 微载体培养（micro-carrier culture） 是在悬浮培养 的基础上，结合微载体的细胞培养技术。 微载体是直径10035m的微小颗粒，对细胞无毒 性，细胞可贴附其上长成单层。 第二节 病
4、毒与细胞的相互作用 n杀细胞感染 n非杀细胞感染 引致持续感染，对细胞代谢无影响。 n产生干扰素 生产性感染（productive），病毒感染后能产生和释放 子代病毒颗粒。宿主细胞感染病毒发生的变化可能是细 胞死亡或细胞转化 非生产性感染（nonproductive）或称顿挫感染（ abortive infection） 病毒感染后不形成完整的病毒颗 粒 持续性感染（persistent infection）是指持续长时间 的感染，感染过程中不形成感染性的病毒颗粒 病毒与细胞的相互作用 感染的类型对细胞的影响是否产生传染性病 毒颗粒 例证 杀细胞 细胞病变（CPE），细胞 蛋白质、RNA、DN
5、A合 成被抑制。细胞死亡 是 甲型疱疹病毒、肠 病毒、呼肠孤病毒 持续性、生产性 无CPE，细胞代谢无甚妨 碍，细胞继续分裂， 某些分化的细胞可失去 某些功能 是 瘟病毒、砂粒病毒 、狂犬病毒、大多 数反录病毒 持续性、非生产性 通常无影响否，但可通过共培 养等诱导 脑组织的犬瘟热病 毒 转化 细胞形态改变，细胞可 无限制传代 移植至实验动物可产生 肿瘤 否，致肿瘤DNA病 毒 是，致肿瘤反录病 毒 多瘤病毒、腺病毒 鼠、禽白血病病毒 一、病毒引致的杀细胞变化 细胞病变效应(cytopathic effect,CPE) 由病 毒感染导致的细胞损伤。CPE能在光学显微镜 下观察。常见的细胞形态学
6、变化为细胞变圆、 坏死、溶解、脱落或形成合胞体。有些病毒能 形成包涵体。 细胞肿大 细胞圆缩 形成合胞体 病毒所致的细胞病变 tissue culture cells epithelialepithelioidfibroblastic epithelial cells uninfectedearly infectionlate infection slides from CDC fibroblastic cells uninfectedearly infectionlate infection slides from CDC Formation of multinucleated cells.
7、 能够使半数组织细胞在一定条件下发生细胞 病变的病毒量。用于判定病毒的毒力。 半数组织细胞感染量（tissue culture infectious dose 50, TCID50） 涉及细胞膜的CPE 有囊膜的病毒出芽过程中 能将其融合蛋白直接插入宿主细胞膜，结果导 致膜融合以及合胞体（syncytia）形成。 慢病毒、副粘病毒、麻疹病毒、肺病毒、某 些疱疹病毒等感染 涉及细胞骨架的CPE 微丝（如actin）、中介 丝（如vimentin）及微管（如tubulin）等细 胞骨架与细胞结构的完整性、物质运输及运动 性等有关。 病毒引致的细胞凋亡与坏死 坏死（necrosis）、 凋亡（apo
8、ptosis） 图2432-2 感染犬瘟热病毒凋亡的 Vero细胞的电镜照片 病毒感染抗体依赖的增强作用（Antibody- dependent enhancement of viral infection, ADE） 在病毒感染过程中，宿主产生的抗体与病 毒结合，非但未能阻断病毒吸附宿主细胞，反而增 强了病毒对细胞的感染，提高了病毒的滴度。 （一）空斑试验 将适当浓度的病毒悬液加入单层细胞培养 中，当病毒吸附细胞后，再覆盖一层融化 的琼脂。病毒在细胞内复制后产生局限性 病灶，病灶逐渐扩大，肉眼也能看见，此 即空斑(plaque)。 空斑是由一个感染性病毒粒子复制形成的，类似于细菌的菌落 ，称
9、为空斑形成单位（PFU）。病毒悬液中的感染性病毒量以 每毫升含有的PFU来表示。 空斑试验的用途： 1. 测定病毒数量 2. 纯化病毒 单个空斑作悬液，梯度稀释后再作空斑， 可获得病毒克隆。 3. 鉴定病毒 不同病毒的空斑具有不同的特征。 （二）包涵体（inclusion body) 定义：是某些病毒感染细胞产生的特征性的 形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或 胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小 数量不等的圆形或不规则形的团块状结构， 称为包涵体。 图324-4 疱疹病毒的包涵体 包涵体的性质 n病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的Negri氏体 n大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒 的包涵
10、体 n细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的 包涵体 定义：由病毒或诱生剂刺激机体细胞产生的具有抗病毒 、抗肿瘤和免疫调节作用的糖蛋白。 种类：、干扰素。 抗病毒作用：干扰素不直接作用于病毒，而是作用于 邻近的细胞，使其产生抗病毒蛋白，这些抗病毒蛋白降 解病毒mRNA、抑制蛋白合成。 干扰素作用具有宿主特异性，而无病毒特异性。 二、干扰素（IFN） 干扰素抗病毒机制 RNA干扰（RNA interference, RNAi）指细胞 利用内源或外源的小分子双股RNA片段，特异性地降解 同源基因的mRNA，从而导致靶基因转录后的基因沉默 （post translational gene silen
11、ce, PTGS）的现象。 复习思考题 1. 细胞培养有何优点？ 2. 原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系的概念 。 3. CPE、PFU、空斑、包涵体和干扰素的概念 。 单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 *33 第五章 病毒的致病机理 病毒的持续性感染 类型 持续性感染（persistent infections） 不论是否发病，感染性病 毒始终存在。 潜伏感染（latent infections） 又名隐性感染。除非激活，一般 并不能发现感染性病毒颗粒。 长程感染（slow infections） 具有感染性的病毒在一个很长的 临床前阶段逐渐增多，最终导致缓慢的、渐进性致死疾病。 迟发性临床症状的急性感染（acute infection with late clinical manifestiations） 此类病毒的持续性复制与疾病的进程无关。