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1、,13.1引言,性细胞：狭义、广义 性细胞：直接参加受精作用的雌、雄配子（卵细胞与精细胞）、花粉原生质体、脱外壁花粉、胚囊。（合子、初生胚乳核）,花粉原生质体与脱外壁花粉的分离 生殖细胞与精细胞的分离 胚囊、卵细胞、合子与中央细胞的分离,13.2花粉原生质体与脱外壁花粉的分离,花粉粒 脱外壁花粉 花粉原生质体,13.2.1花粉原生质体,80年代中期三条分离路线： 1、化学脱壁：Southworth（1974） Loewus等（1985）多糖试剂MMNO 2、酶法脱壁：Tanaka等（1987）麝香百合成熟花粉的原生质体 周嫦（1988）鸢尾、萱草、风雨花成熟花粉原 生质体和萱草幼嫩花粉原生质体
2、 3、非酶法脱壁：Weaver等（1990）NaCl溶液滴加于菜豆成熟 花粉,成功,四种分离方法： 1、一步酶解法 麝香百合、鸢尾、风雨花的成熟花粉以及萱草不同发育时期的花粉原生质体； 单子叶植物百合科、鸢尾科、石蒜科等，双子叶植物芸薹属。 适用于具宽大萌发沟花粉的植物 过程：花粉 酶液 水合膨胀 外壁沿萌发沟裂开，内壁大面积地暴露 酶的作用下分解 释放出原生质体 2、水解-酶解二步法 分两步：花粉在溶液中充分水合，是外壁裂开， 转入酶液，降解内壁，获得原生质体 甘蓝型油菜与紫菜薹成熟花粉、凌霄花,四种分离方法： 3、萌发-酶解二步法 分离烟草等植物的花粉原生质体 汪泳与周嫦（1995）建立
3、步骤： 成熟的花粉置于花粉萌发培养基中，待花粉大量萌发，长出短花 粉管时及时转入酶液中酶解。 酶液降解花粉管壁，再扩展至花粉内壁，释放出原生质体 注意：花粉管过长时，形成亚原生质体。 4、花药预培养法 分离烟草幼嫩花粉原生质体，夏慧君等（1996）建立 三步：花蕾低温预处理 收集花药，将其漂浮在液体培养基上，培养中花药裂开， 花粉释放到培养基中，继续培养，大量的花粉外壁裂开 。 将裂外壁花粉转入酶液。内壁被酶降解，外壁脱落，游离 出花粉原生质体。,小结： 根据不同植物花粉及其花粉壁的特点采取不同的分离方法。 根据不同花粉发育时期，其形态结构与生理状态的不同而用不同方法。 分离方法与其细节可影响
4、分离效果。如酶的种类、酶解时间、温度、浓度等。,13.2.2脱外壁花粉,三种分离方法 1、低渗水合法： 将花粉置于低渗溶液中水合，使外壁脱落。芸薹属、风雨花、荷花。 2、花药预培养法： 烟草幼嫩花粉原生质体法衍生 三步：花蕾低温预处理-花药漂浮培养-酶解 酶解时间短 3、低温水合-热激-渗激法 芸薹属脱外壁花粉分离的方法，分离出青菜与紫菜薹脱外壁花粉 三步：将花粉置于水合液中，低温下较长时间水合消除内外 壁的联系，较好地保持花粉的生活力 将花粉转入较高温度下作短时热激处理 再转入低渗溶液，作短时震荡渗激处理。,13.3生殖细胞与精细胞的分离,两类分离方法： 机械分离法 渗透压冲击法,13.3.
5、1生殖细胞,四种分离方法： 1、一步渗透压冲击法 花粉置于低渗蔗糖溶液中保温一段时间后，花粉自行破裂，生殖细胞随营养细胞质流出。 棉花生殖细胞 适用于花粉容易在蔗糖溶液中破裂的植物 2、二步渗透压冲击法 适用于花粉容易萌发的植物 将花粉置于等渗蔗糖溶液中培养，当大部分花粉开始萌发时，加入蒸馏水使渗透压骤降，导致花粉管尖端破裂，释放出生殖细胞。 蚕豆、石蒜、风雨花、玉帘、烟草、凤仙花等,四种分离方法： 3、低酶法 将花粉置于低浓度的酶溶液与低渗蔗糖溶液中保温，促使花粉破裂释放出生殖细胞。 黄花菜、韭菜、朱顶红、唐菖蒲、鸢尾等 4、花粉原生质体释放法 分离出花粉原生质体，用渗透压冲击法或机械法使花
6、粉原生质体破裂，获得生殖细胞。 麝香百合分离出生殖细胞 黄花菜、韭菜、鸢尾、唐菖蒲、朱顶红、风雨花等分离出花粉原生质体 局限性在于许多植物花粉原生质体尚未分离成功。,13.3.2精细胞,三细胞花粉的精细胞分离： 1、渗透压冲击法 将花粉置于含一定浓度渗透压调节剂的介质中，任其吸水后自行破裂而释放精细胞。 白花丹、玉米、小麦、甜菜等 优点：花粉壁不太破碎，碎片易于过滤清除。 花粉发育时期与生理状态对渗透压冲击效果有很大影响。 2、研磨法 将悬浮于一定介质中的花粉用玻璃匀浆器或其他装置轻轻研磨，使花粉破裂而又不损伤精细胞。 油菜、甘蓝、紫菜薹、非洲菊、菠菜等 优点：手续简便，不过分依赖花粉的成熟度
7、与生理状态。 但研磨需要手工技巧，且研磨后花粉壁碎片较难清除。,二细胞花粉的精细胞分离 1、花粉离体培养法 花粉在培养基中人工萌发，待形成精细胞后，应用渗透压冲击法或研磨使花粉管破裂。 百合、蓝猪耳 人工萌发的花粉管在精细胞形成上常不同步，由此分离的精细胞群体中不免混杂一些尚未分裂的生殖细胞，使精细胞纯度降低。 2、活体-离体法 Shivanna等（1988）首创，分离杜鹃与唐菖蒲精细胞 将花粉授于柱头上，切下花柱插入培养基，待众多花粉管中已形成精细胞，花粉管自花柱切口长出，然后用渗透压冲击或酶法促使花粉管尖端破裂。 莫永胜与杨弘远（1992）5科8种（鸢尾、棉花、朱顶红、烟草、 黄花菜、萱草
8、、玉帘等）分离出精细胞 Tian与Russell（1997）分离烟草精细胞 分离的精细胞纯度高，且接近受精前的发育状态,13.4胚囊、卵细胞、合子与中央细胞的分离,分离程序： 人工解剖，除去子房壁，分离出胚珠。 从胚珠中设法分离出胚囊。 卵细胞、合子和中央细胞要从胚囊中进一步分离或由胚珠直接分离。,13.4.1胚囊,生活胚囊的分离一般采用酶法。 将胚珠置于酶液中酶解，使珠被与珠心细胞离散，裸露出胚囊。在酶解的基础上要适当辅以机械处理（振荡、吸打、压片或解剖），提高分离的效果。 1975年俄国科学家分离出烟草生活胚囊 20世纪80年代，周嫦与杨弘远等在金鱼草、向日葵与烟草中用酶 解振荡法分离出生
9、活胚囊 胡适宜等用酶法压片法分离出烟草、颠茄胚囊及其成员细胞。 Mol（1986）报道了蓝猪耳生活胚囊及其成员细胞的分离。 其他植物：玉米、麝香百合、白花丹、矮牵牛等。,孙蒙祥等（1993）建立新的酶解-渗透压冲击法，提高分离效果，获得了卵细胞等胚囊成员细胞。 方法之一：将胚珠置于等渗甘露醇的酶液中保温，再转入低渗甘露醇溶液中冲击，辅以轻缓吸打。 方法之二：将胚珠直接置于低渗甘露醇的酶液处理。在酶与低渗双重作用下，胚囊由胚珠的珠孔或胚柄断面溢出。,13.4.2卵细胞、合子与中央细胞,胡适宜等（1985）首次分离出烟草胚囊成员细胞。 分离技术分为三类： 1、酶解法 分离出卵细胞、合子与中央细胞等
10、 在酶法分离胚囊的基础上延长酶解时间，降解胚囊壁，可使卵细胞等溢出。 蓝猪耳、矮牵牛、烟草等卵细胞和/或中央细胞 酶解-研磨法分离出烟草合子 2、解剖法 单独应用显微解剖技术，直接从胚珠中分离卵细胞等。 禾本科获得成功：大麦、小麦、玉米、水稻等卵细胞与合子分离 分离水稻卵细胞与合子时用了胚珠纵剖、横剖与积压三种方式。,3、酶解-解剖法 胚珠先酶解，然后作显微解剖 玉米、白花丹、黑麦草、烟草、小麦和水稻等 小结： 1.酶解法操作简单，适合分离大量的胚珠。但分离率低，酶可能产生毒害，影响材料的生活力。适用于胚珠小而数量多，具薄珠心的植物材料如烟草。 2.解剖法操作准确度高，分离率高，无酶伤害，易保持材料的生活力。但需熟练的操作技巧，分离速度偏慢。多用于胚珠较大数量较少，具厚珠心的植物材料，如禾本科植物。 3.酶解-解剖法以解剖为主，兼取酶法离解胚珠细胞间联系的优点，在不少植物上获得。玉米,13.5结语,目前，在植物性细胞分离技术的基础上已转入了性细胞的培养、融合、转化等实验体系的建立，并开展相关的细胞生物学与分子生物学研究。 幼嫩花粉原生质体的培养取得了阶段性进展 脱外壁花粉新系统的建立 利用分离的生殖细胞、精细胞、胚囊及胚囊细胞开展细胞生物学研究 存在的问题： 分离成功的植物材料有限 分离的首次成功和分离技术的完善之间有距离，需要不断探索改进。,