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1、DNA RNA 蛋白质,中心法则,复制,转录,翻译,逆转录,RNA复制,1,DNA的合成与损伤修复,第一节,一、DNA复制的几个基本原则,3,(一)半保 留复制(semiconservative replication),模板：亲代的DNA双链(每股均可为模板),原则：按碱基配对原则(A-T、G-C)指导新链的合成,特点：合成的两个子代DNA分子碱基序列与亲代分 子完全一样，但其中一条链来自于亲代的 DNA链，另一条链是新合成的链,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G
2、T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,亲代DNA,子代DNA,新合成 的链,4,(亲代)DNA两股链反向平行两股子链反向平行,5 ,3 ,3 ,5 ,5 ,3,3 ,5 ,3 ,5,5 ,3,亲代,子代,子代,5,(二)半不连续复制(semidiscontinuous replication),存在两种DNA聚合酶？ 53 35 体内仅有53DNA聚合酶 所有DNA聚合酶
3、只能催化53方向合成,35 如何合成? 岗崎片段,6,3,5,3,5,解链方向,3,3,5,前导链 (leading strand),随从链 (lagging strand),岗崎片段,5,7,半不连续复制,不能催化两个游离的dNTP聚合 需要含3-OH的引物(RNA),RNA聚合酶抑制物能抑制DNA合成 岗崎片段5端有RNA引物,根据,DNA聚合酶,(三)RNA引物(RNA prime),8,RNA聚合酶,能催化两个游离的NTP聚合 其产物提供3-OH,9,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,RNA引物,10,RNA引物最后要被DNA聚合酶除去，空隙由 该酶补满，缺口再
4、由DNA连接酶连接。 RNA引物的作用： 为DNA聚合酶提供合成核苷酸所需的3-OH 可尽量减小DNA复制起始处的突变,11,(四)复制的真实性,DNA的半保留复制 遵守严格的碱基配对规律 RNA引物 尽量减少DNA复制起始处的突变 DNA聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能 复制出错时有即时的校读功能(35外切酶功能) DNA损伤的修复机制,12,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP(dNTP) 聚合酶(polymerase): DNA指导的DNA聚合酶， 简写为DNA pol，需Mg2+ 模板(template): 解开成单链的DNA母链 引物(prim
5、er): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合,DNA复制的条件,13,二、参与DNA复制的一些酶类和蛋白质,DNA聚合酶：、 (原核生物) 、 、 (真核生物) 解链、解旋酶类：DNA解链酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、DNA拓扑异构酶/ 引发体 DNA连接酶,其他的酶和蛋白质,14,3, 5-磷酸二酯键,3,(一)DNA聚合酶,5,15,1. 大肠杆菌DNA聚合酶,1955年Kornberg发现了DNA聚合酶 简称为pol，也称为Kornberg酶,活性：53 的聚合酶活性 53 核酸外切酶活性 35 核酸外切酶活性,16,35 53 外切酶 聚合酶,N,C,53 外切酶,小片段,大片
6、段(klenow片段),切除RNA引物 损伤修复,校读功能,聚合功能,DNA聚合酶是多功能酶,17,5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |,3 T C G A A G T C C T A C C G A C 5,?,5 A G C U U C A G G A U 3 | | | | | | | | | | |,核酸外切酶活性,18,DNA聚合酶全酶 2个核心酶 -复合物2 DNA夹子(4个),2. 大肠杆菌DNA聚合酶,19,特点,一种非常高的续进性酶 催化活性比DNA聚合酶高100倍 产物真实性高 DNA聚合酶是DNA复制的主要酶，
7、是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶,20,3. 真核细胞的DNA聚合酶,DNA-pol 负责合成引物(去除后的填补),DNA-pol 负责线粒体DNA的复制与损 伤修复,DNA-pol 、 DNA复制、切除修复,21,DNA-pol 碱基切除修复,(二)解旋、解链酶类,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用；复制不断延伸，螺旋不断解开解链、解旋酶类 保持解开模板的单链状态单链DNA结合蛋白 解旋后在复制前方产生很大的张力，DNA发生缠结后DNA拓扑异构酶,22,1. DNA解链酶(DNA helicase),解开DNA双链，具有ATP酶的活性 每解开1对碱基
8、消耗2个ATP,23,3,5,3,5,SSB,SSB,2. 单链DNA结合蛋白(single strand binding protein, SSB),24,3. DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,25,26,分类,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；解除张力后封闭切口。 反应不需ATP,拓扑异构酶,暂时切断DNA双链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛，随后再连接断端。 需要ATP供能,27,4. 引发体(primosome),DnaA 结合至复制起始部位 DnaB 具有解链酶的作用 DnaC 协同DnaB DnaG 引物酶
9、，是一种RNA聚合酶,由多种蛋白质及酶组成，是DNA复制 开始所必需的。,28,3,5,3,5,引物,引物酶,Dna A,Dna B、Dna C,DNA 拓扑异构酶,SSB,引发体和引物,29,5,3 OH,5,3,有缺口的DNA链,5,3,缺口封闭,30,5. DNA连接酶(DNA ligase),连接双链DNA分子中一条链上的缺口 连接双链DNA分子中双链的缺口 不能连接两分子单链DNA,缺口填补,x,31,参与复制的酶类与蛋白质,pol 真正的复制酶 pol 切除引物、填补引物遗留空隙 解链酶 解开DNA双链 SSB 稳定与保护已解开的单链 DNA拓扑异构酶 克服解链中的打结缠绕、解 除
10、张力 引物酶 合成RNA引物 DNA连接酶 连接缺口、形成磷酸二酯键,32,三、DNA复制过程,大肠杆菌复制时有特定的起始部位称oriC,oriC,33,(一)复制的起始,DNA双链复制起始点oriC,DnaA,DnaB、DnaC,DNA双链解开成单链DNA,SSB,引物酶,RNA引物(3-OH),DNA聚合酶、dNTP,和3-OH形成3,5磷酸二酯键,解链、解旋酶,拓扑异构酶,34,复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制。在电子显微镜下看到DNA复制前进部位伸展成叉状，称为复制叉(replication fork)。,复制从oriC开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制。,35
11、,原核生物大肠杆菌,真核细胞DNA分子巨大，有许多个复制起始点，同时进行复制，形成多个复制单位。,36,真核生物,(二)复制的延长,指在DNA聚合酶的催化下，新合成的DNA链不断延长。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 大肠杆菌岗崎片段的长度为10002000个核苷酸。前导链合成10002000个核苷酸后，随从链开始合成。 DNA聚合酶全酶2个核心酶分别负责前导链和随从链的合成。,37,5,3,38,Pol切除RNA引物,Pol填补空隙,39,(三)复制的终止,四、真核生物端粒与端粒酶,末端问题 真核生物染色体线性DNA分子每复制一次，新合成子链的5端RNA引物被切除后，就会留下末端的空缺。,
12、40,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,5,染色体末端DNA,染色体末端DNA,41,真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 数百个串联重复GT丰富的短寡核苷酸构成的序列 不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用,42,端粒(telomere),端粒酶,RNA 作为合成端粒DNA的模板 蛋白质 一种特殊逆转录酶，以其中的RNA为模 板催化合成端粒DNA，具有种属特异性,43,44,45,生殖细胞、干细胞：有端粒酶活性 体细胞：无端粒酶活性，端粒随分裂而缩短， 最终导致细胞衰老、调亡，是正常的 生理现象。 肿瘤细胞：端粒酶活性重新出现，对端粒进行补 偿，使之
13、永不衰老，形成恶性增殖。,UV,46,1. 点突变,(一)DNA损伤的类型,五、DNA的损伤与修复,2. 缺失和插入 一个碱基/一段核苷酸链/整个基因,3. 重排 分子内较大片段的交换,47,切除修复是细胞内最重要和有效的修复机制 原核生物中主要由DNA pol和连接酶完成 遗传性疾病如着色性干皮病由于缺乏UV特异的切割酶造成的,48,(二)切除修复,1. 核苷酸切除修复,8个核苷酸,4个核苷酸,UVrABC切割酶,DNA损伤的切除修复,49,2. 碱基切除修复,DNA糖苷酶识别切除损伤的碱基 AP核酸内切酶切除AP附近的磷酸二酯键 DNA聚合酶填补 DNA连接酶连接,50,DNA聚合酶,DN
14、A连接酶,AP核酸内切酶,DNA糖苷酶,U,DNA聚合酶,G,51,DNA中的C容易突变成U 尿嘧啶DNA糖苷酶识别DNA中的U(由C突 变而来) 若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U 所以DNA中U甲基化/耗能生成T DNA碱基中T的存在，增加遗传信息的稳定性 RNA中的U：数量多/半衰期短/经济,DNA碱基的组成为何是“T”?,52,六、逆转录、逆转录病毒及癌基因,1. 逆转录酶,(一)逆转录病毒及逆转录酶,以RNA为模板，有逆转录酶的参与，在4种dNTP存在及合适条件下，按碱基互补配对的原则，合成互补DNA(complementary DNA, cDNA)。,53,RNA,RNA D
15、NA(-),DNA(-),DNA(+) DNA(-), RNA指导的DNA合成, RNA的水解, DNA指导的DNA合成,逆转录酶具有催化三种反应的活性,54,单链RNA病毒 进入宿主细胞 双链DNA前病毒 整合到宿主细胞基因组DNA中 宿主细胞RNA聚合酶 mRNA 病毒RNA基因组 作为合成相应 病毒蛋白质的模板 包装成新的病毒颗粒，离开宿主,2. 逆转录病毒的生活周期,55,逆转录病毒与宿主细胞基因整合过程示意图,RNA病毒粒子,病毒RNA,RNA DNA,DNA(前病毒),和宿主细胞DNA整合,整合后的DNA进行复制,转录、翻译,56,逆转录酶,能在体外引起细胞转化，在体内诱发肿瘤的基
16、因。,1. 癌基因(oncogene),(二)癌基因与抑癌基因,原癌基因(proto-oncogenes, pro-onc)/ 细胞癌基因(cellular-oncogene, c-onc),存在于生物正常细胞基因组中的癌基因。 当细胞受到致癌因素的作用后，原癌基因被激活并具有转化细胞的活力，导致细胞癌变，使细胞增殖、分化异常，如src等。,57,是一类其蛋白质产物对细胞生长、增殖起负调控的作用的基因，能抑制细胞进入增殖周期，促使细胞成熟，朝终极分化。,2. 抑癌基因(tumor suppresor genes),58,与负责促进细胞生长的正调控基因协调表达， 共同维持细胞的正常生长、增殖与分化 抑癌基因突变、丧失抑癌作用，具备促癌效应 Rb基因、P53基因,