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1、第第 六六 章章 分子生物学基本研究法（下）分子生物学基本研究法（下）基因功能研究技术基因功能研究技术6.1 基因表达研究技术基因表达研究技术6.2 基因敲除技术基因敲除技术6.3 蛋白质及蛋白质及DNA相互作用技术相互作用技术6.4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析6.5 其它分子生物学技术其它分子生物学技术6.1 基因表达研究技术基因表达研究技术6.1.1 基因表达系列分析技术（基因表达系列分析技术（Serial Analysis of Gene Expression，SAGE）是以是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。任何长度超过式的技术
2、。任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。的表达频率。图图6-1 常规常规SAGE方方法（法（short SAGE）基本流程基本流程又叫接头，末端有氨基，防止5端相连锚定酶，即限制性内切酶Schematic of SAGE method:锚定酶识别锚定酶识别4个碱基。分离个碱基。分离3端酶解片段并将端酶解片段并将其分为两份，分别与连接子其分为两份，分别与连接子1和连接子和连接子2（均（均含有含有IIS类标
3、签酶的识别位点）结合，用标签类标签酶的识别位点）结合，用标签酶（一种酶（一种类限制酶，它能在距离识别位点类限制酶，它能在距离识别位点数个或十数个碱基的位置切割数个或十数个碱基的位置切割DNA双链）如双链）如BsmF1酶切，将含有连接子酶切，将含有连接子1和和2的样品混合的样品混合后测序分析。后测序分析。LongSAGE技术技术Short SAGE技术用技术用14个碱基个碱基的标签代表一个基的标签代表一个基因，不能覆盖大基因组（如人类）内所有的基因因，不能覆盖大基因组（如人类）内所有的基因序列。序列。LongSAGE技术所用标签来自转录物技术所用标签来自转录物3端一段端一段21bp的序列，可以进
4、行快速分析并与基因组序列的序列，可以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。其原理与数据相匹配。其原理与ShortSAGE方法类似，只方法类似，只是用了不同的是用了不同的IIS类标签酶（类标签酶（MmeI），并将程序），并将程序做了相应修改。做了相应修改。6.1.2 RNA的选择性剪接技术的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个个mRNA前体产生不同的前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。剪接异构体的过程。包括：包括：平衡剪切、平衡剪切、5选择性剪切、选择性剪切、3选择性剪切、外选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。显子遗漏型剪
5、切及相互排斥性剪切。图图6-2 6-2 选择性剪切的不同类型选择性剪切的不同类型 图图6-4 6-4 果蝇（果蝇（Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster）的）的DscamDscam基因基因可以通过可变剪接产生可以通过可变剪接产生3800038000多种可能的多种可能的mRNAmRNA异构体异构体 6.1.3 原位杂交技术原位杂交技术原位杂交原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)是是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体检测体系，在组织、细胞、
6、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的的mRNA分子，两者杂交产生双链分子，两者杂交产生双链RNA，可，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。因的表达产物做出定性定量分析。mRNA
7、mRNA的互补链，的互补链，杂交信号集中于杂交信号集中于纤维细胞中。纤维细胞中。负对照，负对照，mRNAmRNA的的同义链同义链,无杂交无杂交信号。信号。正对照，正对照，UBQ10UBQ10杂交信号遍布于杂交信号遍布于整个胚珠。整个胚珠。Expression pattern of BARD1In Situ hybridizationHan P,Li Q,Zhu YX.(2008)Mutation in the Arabidopsis BARD1 BRCT Domain Releases WUSCHEL Expression from the Organizing Center.The Plan
8、t Cell 20:1482-1493.荧光原位杂交荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH).对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该体来确定该DNA序列在染色体上的位置。序列在染色体上的位置。人肌糖原磷酸人肌糖原磷酸酶基因在酶基因在1111号号染色体的定位染色体的定位结果。结果。6.1.4 基因定点突变基因定点突变(site-directed m
9、utagenesis).通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。图图6-6 6-6 寡核寡核苷酸介导的苷酸介导的DNADNA突变技突变技术术 目前，主要采用两种目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序
10、列中进行定点术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。突变。重重叠叠延延伸伸诱诱变变法法示示意意图图图图6-8 6-8 大引物诱变法示意图大引物诱变法示意图 6.2 基因敲除技术基因敲除技术6.2.1 基本原理基本原理经典遗传学（经典遗传学（Forward genetics）是从一）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。找出该基因的编码序列。现代遗传学（现代遗传学（Reverse genetics，反向遗，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。进而推导出该
11、基因的功能。基因敲除（基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，）又称基因打靶，通过外源通过外源DNADNA与染色体与染色体DNADNA之间的同源重组，之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传可与目的片段共同稳定遗传等特点。等特点。基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。除（又称不完全基因敲除）两种。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型
12、细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。间和空间的基因敲除。噬菌体的噬菌体的Cre/Loxp系统、系统、Gin/Gix系统、酵系统、酵母细胞的母细胞的FLP/FRT系统和系统和R/RS系统是现阶段系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系系统应用最为广泛。统应用最为广泛。图图6-9 用取代型（用取代型（a）或插入型）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验）载体进行完全基因敲除实验 图图6-10 正负筛选法（正负筛选法（PNS法）筛选已发生同法）筛选已发生同源
13、重组的细胞源重组的细胞 正向选择基因正向选择基因neo通常被插入载体靶通常被插入载体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。重组法置换靶基因的功能区。负向选择基因负向选择基因HSV-tk则被置于目的片段则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可能被整合到基因组中，导负向选择基因就可能被整合到基因组中，导致细胞死亡。致细胞死亡。6.2.2 高等动物基因敲除技术高等动物基因敲除技术真核生物基因敲除的技
14、术路线主要包括构真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，导入胚胎干细胞纯系中，使外源使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的分发生同源重组，将重组载体中的DNA序序列整合到内源基因组中并得以表达。列整合到内源基因组中并得以表达。图图6-12 模式动物小鼠中模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术完全基因敲除的主要技术策略与应用。策略与应用。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比
15、显微注射低，操作使用电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。方便。胚胎干细胞（胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。6.2.3 植物基因敲除技术植物基因敲除技术T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报介导转化，将带有报告基因的告基因的DNA序列整合到基因组序列整合到基因组DNA上，如上，如果这段果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就插入到目的基因内部或附近，就会
16、影响该基因的表达，从而使该基因会影响该基因的表达，从而使该基因“失失活活”。图图6-14 6-14 植物基因敲除植物基因敲除及突变体筛选及突变体筛选 a.a.引物设计。引物设计。LPLP和和RPRP分别代表插入基分别代表插入基因两端的引物，因两端的引物，LBLB是指载体上的一段是指载体上的一段引物，目的基因片引物，目的基因片段段(设为设为900bp)900bp)。旁。旁邻序列是经测序后邻序列是经测序后获得的获得的DNADNA序列。序列。b b，PCRPCR产物电泳结果。产物电泳结果。分别代表野生型、分别代表野生型、杂合子和纯合子杂合子和纯合子PCRPCR条带。条带。Identifiation
17、of bard1-3 homozygous lines6.3 蛋白质及蛋白质及DNA相互作用技术相互作用技术6.3.1 酵母单杂交系统酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system）是上世纪是上世纪90年代中发展起来的研究年代中发展起来的研究DNA-蛋蛋白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作蛋白质之间的相互作用，并通过筛选用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。互作用蛋白的编码基因。将顺式作用元件与最基本启动子（将顺式作用元件与最基本启动子（mi
18、nimal promoter，Pmin）相连并将报告基因连到）相连并将报告基因连到Pmin下游，将待测转录因子下游，将待测转录因子cDNA与酵母转与酵母转录激活结构域（录激活结构域（transcription-activating domain,AD）融合表达载体导入酵母细胞，）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就激活就激活Pmin启动子，报告基因表达。启动子，报告基因表达。图图6-15 6-15 酵母单杂交的基本原理示意图酵母单杂交的基本原理示意图 图图6-16 从拟南从拟南芥芥cDNA文库中文库中筛选与顺式元筛选与顺式
19、元件件DRE结合的结合的转录因子示意转录因子示意图。图。将不同基因或基因片段分别克隆到将不同基因或基因片段分别克隆到pYF503pYF503中中(GAL4 AD(GAL4 AD 为为GAL4 GAL4 激活结构域激活结构域,empty vector,empty vector 表示无基因克隆到表示无基因克隆到pYF503pYF503中中),),转入酵母中表转入酵母中表达达N N端带有端带有GAL4 DNAGAL4 DNA结合结构域的融合蛋白，结合结构域的融合蛋白，观察报告基因表达与否。观察报告基因表达与否。Identification of trans-activation property o
20、f QRAP2 by yeast one-hybrid assay.Plasmid DNA from various constructs was transformed into yeast cells and the abilities of transcription activation of the recombinant protein was identified via blue/white selection.No blue color was observed in yeast cells transformed with either the empty vector(c
21、ontains only the GAL4 DNA-binding domain)a full-length UBQ10 gene the C-terminus(from amino acid 113-292)of QRAP2 ligated to the GAL4 DNA-binding domain.6.3.2 酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）真 核 生 物 转 录 调 控 因 子 具 有 组 件 式 结 构真 核 生 物 转 录 调 控 因 子 具 有 组 件 式 结 构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上）特征，这些蛋白往
22、往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。）是转录激活因子发挥功能所必须的。BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的由不同转录调控因子的BD和和AD所形成的杂合蛋白却所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。能行使激活转录的功能。图图6-17 6-17 酵母双杂交技术原理示意图酵母双杂交技术原理示意图 6.3.3 体外蛋白质相互作
23、用技术体外蛋白质相互作用技术1、Far Western印迹技术印迹技术用用32P标记的体外表达蛋白作探针标记的体外表达蛋白作探针,直接检测直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的的cDNA。图图6-18 Far Western印印迹试验迹试验 2、GST融合蛋白沉降技术融合蛋白沉降技术利用利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。用蛋白。图图6-19 GST融合蛋融合蛋白沉降技术流程。白沉降技术流程。3、蛋白质芯片技术、蛋白质芯片技术蛋白
24、质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点互作用蛋白点。Gong W.et al.(2008)Molecular Plant1:27-41.4、等离子表面共振技术等离子表面共振技术将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经
25、过时，如果有蛋白质同如果有蛋白质同“诱饵诱饵”蛋白发生相互作用，蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。升，导致共振角度的改变。图图6-21 6-21 等离子表面共振技术示意图等离子表面共振技术示意图 5、免疫共沉淀技术、免疫共沉淀技术(Co-IP)将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将过滤法在固体基质和抗
26、体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。免疫共沉淀免疫共沉淀示意图示意图 6.3.4 细胞内蛋白质相互作用研究细胞内蛋白质相互作用研究荧光共振荧光共振能量转移法（能量转移法（FRET）FRET荧光能量转移有三个基本条件：荧光能量转移有三个基本条件：（1）给体与受体在合适的距离（）给体与受体在合适的距离（110 nm）；）；（2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）；定的重叠（这是能量匹配的条件）；（3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极（
27、这是偶极-偶极耦合作用的条件）。偶极耦合作用的条件）。图图6-23 荧光共振能量转移法荧光共振能量转移法 FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不同，没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。常用的探针可根据需要组成不同的探针对。常用的探针有：有：荧光蛋白荧光蛋白传统有机染料传统有机染料镧系染料镧系染料荧光蛋白，一类能发射荧光的天然蛋白及其荧光蛋白，一
28、类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。突变体。传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。等。镧系染料，金属染料。一般与有机染料联用，镧系染料，金属染料。一般与有机染料联用，分别作为分别作为FRET的给体或受体，以提高检测的的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比。准确性和信噪比。6.3.5 RNAi（RNA interference,RNA干涉）干涉）技术及其应用技术及其应用RNAi技术利用双链小技术利用双链小RNA高效、特异性
29、降解高效、特异性降解细胞内同源细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来的命名来源于安德鲁源于安德鲁法尔法尔1998年在年在自然自然杂志上的杂志上的论文。论文。RNAi作用机作用机制示意图。制示意图。研究发现，双链研究发现，双链RNA是是RNAi的触发物，引的触发物，引发与之互补的单链发与之互补的单链RNA（ssRNA,single-stranded RNA）的降解。）的降解。经过经过Dicer（一种具有（一种具有RNAase III活性的核酸活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链酶）的加工，细胞中较长的双
30、链RNA（30个个核苷酸以上）首先被降解形成核苷酸以上）首先被降解形成2125个核苷个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目标），并有效地定位目标mRNA。由由siRNA中的反义链参与指导合成被称为中的反义链参与指导合成被称为RNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白）的核蛋白体，再由体，再由RISC介导切割目的介导切割目的mRNA分子中与分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。基因表达的功能。Phenotypic character
31、ization of bard1-36.4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析基因芯片（基因芯片（DNA chip），又称），又称DNA微阵列微阵列（DNA microarray）技术是能同时监测大量）技术是能同时监测大量靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基靶基因表达的实验手段，从而迅速准确地在基因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种因组水平上阐述不同生物组织或细胞中各种转转录本（一条基因通过转录形成的一种或多种可录本（一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的供编码蛋白质的成熟的mRNA）的变化规律。的变化规律。基因芯片技术流程图基因芯片技术流程图 简易基因芯片简易基因芯片
32、使用机械臂把使用机械臂把DNA片段点在玻璃片或尼龙膜片段点在玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以上，经过物理吸附作用达到固定化。也可以直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组理，便可以观察到大规模的基因群在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达模式。下的表达模式。包含包含280个棉花个棉花cDNA的简易芯的简
33、易芯片的杂交图谱。片的杂交图谱。Ji SJ et al.(2003)Nucleic Acid Research,31:2534-2543.纤维细胞组织RNA杂交结果胚珠细胞组织RNA杂交结果大规模基因芯片（大于大规模基因芯片（大于10000个基因）的应用个基因）的应用基因芯片可用于进行基因芯片可用于进行基因诊断基因诊断。先建立正常人。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的号图，用可疑病人的cDNAcDNA做探针与之杂交，确做探针与之杂交，确定哪些基因的表达受抑制或激活。定哪些基因的表达受抑制或激活。6.5 其它分子生物学技
34、术其它分子生物学技术1、凝胶滞缓实验凝胶滞缓实验凝胶滞缓试验（凝胶滞缓试验（gel retardation assay），又），又叫作叫作DNA迁移率变动试验（迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究），是用于体外研究DNA与蛋白与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。原理：原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的裸露的DNADNA朝正电极移动的距离与朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此其分子量的对数成反比。如果此时时DNADNA分子与某种蛋白质相结合，分子与某种蛋白质相
35、结合，那么，由于分子量增大，它在凝那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了动的距离也就相应缩短了。2、噬菌体展示技术噬菌体展示技术噬菌体是细菌病毒的总称，英文为噬菌体是细菌病毒的总称，英文为Bacteriophage，来源于希腊文，来源于希腊文“phagos”，有有“吞噬吞噬”之意。之意。噬菌体可被分为噬菌体可被分为溶菌周期溶菌周期和和溶源周期溶源周期两种不同的类型。在两种不同的类型。在溶菌周期溶菌周期，噬菌，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的体将其感染的宿主细胞转变
36、成为噬菌体的“制造厂制造厂”，产生出大量的子代，产生出大量的子代噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作噬菌体颗粒。实验室常将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫作烈性噬菌体烈性噬菌体。溶源周期溶源周期是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体 DNA是是整合到寄主细胞染色体整合到寄主细胞染色体 DNA上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体，叫做周期的噬菌体，叫做温和噬菌体温和噬菌体。噬菌体展示技术的基本原理噬菌体展示技术的基本原理是将编码是将编码“诱饵诱饵”蛋白的蛋白的DNA片段插入噬
37、菌体基因组，并使之与片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中捕获靶蛋白库中与与“诱饵诱饵”相互作用的蛋白质。相互作用的蛋白质。噬菌体展噬菌体展示技术研示技术研究蛋白质究蛋白质相互作用相互作用 3.蛋白质磷酸化分析技术蛋白质磷酸化分析技术由于细胞内可能有多达上千个由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶蛋白激酶（催化（催化体内蛋白质的磷酸化），体内检测某个蛋白激体内蛋白质的磷酸化），体内检
38、测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。查激酶的特异性底物。蛋白激酶体外磷酸化活性分析蛋白激酶体外磷酸化活性分析泳道1、4、5中的蛋白质具有使蛋白质磷酸化的激酶活性，泳道2、3、6中的蛋白质不能使底物蛋白磷酸化 思考题：思考题：1 1、列举两种研究基因表达模式的方法并简述其原理。、列举两种研究基因表达模式的方法并简述其原理。2 2、RNARNA原位杂交的主要实验过程
39、及应用。原位杂交的主要实验过程及应用。3 3、果蝇、果蝇DscamDscam基因通过可变剪接产生基因通过可变剪接产生3800038000多种可能的多种可能的mRNAmRNA异构异构 体，说说其生物学意义。体，说说其生物学意义。4 4、基因定点突变的原理与实验过程。、基因定点突变的原理与实验过程。5 5、什么是完全基因敲除和条件型基因敲除。、什么是完全基因敲除和条件型基因敲除。6 6、比较酵母双杂交系统与免疫共沉淀、比较酵母双杂交系统与免疫共沉淀(Co-IP)(Co-IP)技术在研究蛋白质技术在研究蛋白质 相互作用方面的优缺点。相互作用方面的优缺点。7 7、等离子表面共振技术的原理与实验过程。、等离子表面共振技术的原理与实验过程。8 8、RNAiRNAi技术原理。技术原理。9 9、基因芯片技术及应用。、基因芯片技术及应用。1010、凝胶滞缓实验的原理与应用。、凝胶滞缓实验的原理与应用。