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1、生物技术大实验实验指导（试行）四川农业大学农学院64目录第一章 基因克隆技术3实验一 植物基因组DNA的提取及检测 3实验二 RNA的制备和分析6实验三 蛋白质的提取及检测9实验四 琼脂糖电泳技术11实验五 PCR基因扩增及其影响因素分析17实验六 核酸印迹技术-DIG标记探针的分子杂交20实验七 DNAHind酶切鉴定24实验八 DNA片段的纯化回收26实验九 DNA体外重组29实验十 重组DNA的蓝白筛选31第二章 植物基因转化技术35实验一 农杆菌浸染的油菜花瓣转化表达GUS基因试验35实验二 基因枪介导的基因转化实验38实验三 转化目的基因的检测- GUS组织化学染色39第三章 植物育
2、种分子标记技术40实验一 RAPD分子标记技术36实验二 SSR分子标记技术（包括垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳）43实验三 SNP分子标记技术47第四章 重组蛋白诱导表达49 实验一 大肠杆菌菌种的活化和菌种的保存49实验二 感受态细胞的制备-采用CaC12 法制备感受态细胞50实验三 碱式裂解法提取表达载体质粒52实验四 大肠杆菌的热激转化法54实验五 Taq聚合酶基因的诱导表达55实验六 Taq聚合酶的提取纯化57实验七 SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Taq聚合酶分子量及纯度58实验八 Taq聚合酶活性单位标定和比活性检测60第五章 生物信息数据库及生物软件的使用61实验一 NCBI等数据库的
3、使用61实验二 常用生物软件的使用63第一章 基因克隆技术实验一 植物基因组DNA的提取及检测实验目的通过本实验学习和掌握从植物组织中提取DNA的方法实验原理基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、R
4、NA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。实验材料玉米、马铃薯等农作物叶片试剂配方1. CTAB 抽提缓冲液Table 1 CTAB Extraction Buffer (100ml)*1 M Tris-Hcl pH 8.0NaCl0.5 M EDTA-8.0CTAB BME7.5 ml6.2g3.0 ml2.0 g0.2 ml* Use freshly made. Warm buffer to 60-65 before adding CTA
5、B (cetyltriethylammonium bromide) and BME (-mercaptoethanol). Add BME just prior to use under a fume hood.2. 氯仿/异戊醇（24:1,v/v）: 将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4保存。实验步骤1. Sample leaves (or other organs) from vase or field. It is preferable to use young leaves after darkness treatment of several days, altho
6、ugh older leaves that are not senescent may be used.2. Place samples in a vacuum bottle with ice to keep them cool (but do not allow to freeze). Samples may be stored at -80 until ready to continue the following steps.NOTE: Once sample frozen, do not allow it to thaw until continuing step 4.3. Remov
7、e mid rib, cut leaves into 1 cm sections, put in a mortar pre-frozen, add liquid nitrogen, grind to a fine powder with a pre-frozen pestle and ladle in a 5 ml centrifuge tube up to about the 2 ml mark. 4. Add 2 ml warm (65) CTAB extraction buffer (table 1) and mix several times by gentle inversion.5
8、. Incubate in a 65 water bath for 30-40 min, mixing gently by inversion every 10 min. NOTE: Wear rubber or plastic gloves and go on with step 6-9 under a fume hood. 6. Add one volume of chloroform / isoamyl alcohol (24:1) and mix gently by inversion for 15 min.7. Spin in a table-top centrifuge with
9、800010000 rpm at room temperature for 15 min. Pipette off top aqueous layer into a new 5 ml tube.NOTE: Below 15 the CTAB and nucleic acid complex may precipitate, ruin preparation and even cause damage to the centrifuge.8. Repeat step 6 and 7 in order to eliminate protein clearly.9. Pipette off top
10、aqueous layer into a new 5 ml tube and add one volume of isopropanol, mix well and keep at -20 for at least 10 min to separate out the DNA.10. Use a pin to hook out the DNA. Rinse it with ice-cold 70% ethanol twice and absolute ethanol once.11. Dry pellet in vacuum desiccator with middle speed for 1
11、0 min.12. Dissolve the DNA in 50 l HPLC H2O. (Add 3 l of 10mg/ml RNase A (pre-boiled), mix by gentle inversion and incubate at 37 for 30 min.)13. Dilute 50-500 times and read absorbance at 260 nm and 280 nm in spectrophotomemter and calculate concentration and quality. 14. Store at 4 for use or -20
12、for a long time.注意事项 1. 叶片磨得越细越好 2. 移液器的使用 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。实验二 RNA的制备和分析实验目的通过本实验学习和掌握从植物组织中提取RNA的方法实验原理RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了R
13、NA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。材料玉米、水稻、小麦等农作物根或叶仪器试剂(一) 仪器 1 低温离心机 2 分光光度计 3 琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜，之后再用DEPC水浸泡冲洗。 4 高压灭菌锅 5 研钵、剪刀、一次性手套等 (二) 药品 1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 异硫氰酸胍 4. 醋酸钠(NaAc) 5. 氯仿 6. 苯酚 7. 甲醛 8. 乙醇 9. 乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 琼脂糖 11. 异丙醇 (三) 试剂配方 1 0.1% DEPC水 0.1
14、ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。 2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。 3. 5MOPS 电泳缓冲液(pH 7.0) MOPS 0.1 mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L (溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤方法11. 取幼叶约250 mg在液氮中研磨至细粉，转入预冷的1.5 ml离心管； 2. 加入1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀； 3. 室温放置5 min后，加入0.5 ml的氯仿，剧烈摇动离心管5 min； 4.
15、 在8条件下，12000 rpm离心15 min； 5. 溶液分为两层，下层为酚氯仿浅红色液层，将上层液体移入干净离心管， 加入0.5 ml异丙醇在1530条件下，沉淀10 min； 6. 然后在, 28条件下，12000 rpm离心10 min，RNA沉淀管壁和底部； 7. 去掉液体部分，加入1 ml 75%酒精洗2次； 8. 风干后，加入25 l DEPC处理过的水溶解RNA，储藏于-80冰箱备用。方法21. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10。b.单层培养细胞 直接在培养板中加
16、入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有how(event) class=t_tagDNA污染。c细胞悬液 离心收集细胞，每5-10106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2将匀浆样品在室温（15-30）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可
17、于2-810000g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。6. 2-810000g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60。7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。8.
18、2-810000g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9. 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75乙醇。2-8不超过7500g离心5分钟，弃上清。10.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200l无RNase的水或0.5SDS,用枪头吸打几次,55-60放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100的去离子甲酰胺溶解，-70保存。注意事项1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中
19、提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10g RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8一星期以上或-5至-20一年以上。3. 分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10g ,肾3-4g ,骨骼肌和脑组织1-1.5g ,胎盘1-4g ,上皮细胞8-15g ,成纤
20、维细胞5-7g 。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底B. RNA沉淀未完全溶解A260/A2801.65 ：A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高B样品匀浆时加的试剂量太少C. 匀浆样品时未在室温放置5分钟D. 吸取水相时混入了有机相E .RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻B. 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70,而保存在了-5至-20C. 细胞在用胰酶处理时过度D. 溶液或离心管未经RNase去除处理E. 电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量
21、太少B. 样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。4. 在研磨过程中，利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。 5. RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类，除了细胞内源RNA酶外，外界环境中均存在RNA酶，所以操作时应戴手套，并注意时刻换新手
22、套。思考题 1. 实验中使用的各种药品的作用？ 2. 真核生物的总RNA提纯后，可以继续做那些工作？ 3. DNA和RNA相比，为什么说提纯植物细胞的mRNA是研究结构基因更关键的一步实验三 蛋白质的提取及检测实验目的熟悉植物叶蛋白的几种提取原理和方法，了解其意义及其应用价值。实验原理以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有
23、机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。植物叶蛋白或称绿色蛋白浓缩物(leafproteinconcentration，简称LPC)，是从新鲜植物叶片中提取的高质量浓缩蛋白质，不仅是畜禽生长发育和生产畜产品的主要营养物质，而且目前也正成为人类的保健营养理想食品之一。天然蛋白存在于为
24、数甚多的植物体内，对其分离应依据人们的利用目的及提取蛋白含量和品质加以考虑。天然蛋白质一般在溶液中呈稳定的亲水胶体状态，故LPC亦称叶蛋白胶。其特点是： (1)水化作用即蛋白质分子表面附有能有效防止蛋白质分子沉淀析出的水化膜； (2)电荷排斥作用水化膜外还有电荷层(具阴、阳离子)能有效地防止蛋白质分子的凝集。故溶液蛋白质颗粒(溶质)呈溶解状态；(3)欲提取植物组织中的蛋白质必须利用溶解度的差异进行分离纯化(如盐析、有机溶剂分级沉淀法、疏水层析、结晶、加热、离心分离等法)，利用分子大小和形状差异进行分离纯化(分子筛层析法)；还可利用电荷性质的差异分离纯化(离子交换法)。只要创造上述影响因素，即可
25、使蛋白质从植物叶片中分离并沉淀出来。植物叶蛋白提取一般遵循如下基本原则：尽可能提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；减少对蛋白质的人为修饰；破坏蛋白与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。根据该原则，植物叶蛋白制备过程中一般需要有四种试剂离液剂：尿素和硫脲等；表面活性剂：又称去垢剂，早期常用NP-40、Tritonx-100等非离子型去垢剂，离子型去垢剂有SDS、胆酸钠、LiDS等，还有象CHAPS(含它的蛋白溶液可以冻存)与Zwittergent等双性离子去垢剂；还原剂：DTT、DTE、TBP、Tris-base等；蛋白酶抑制剂及核酸酶：EDTA、PMS
26、F、蛋白酶抑制剂混合物(Proteaseinhibitorcocktails)等，如为了去除缓冲液中存在的痕量重金属离子，可在其中加入0.15mmol/LEDTA，同时使金属蛋白酶失活。仪器和试剂仪器离心机、移液器、研钵、离心管、冰箱。试剂1.20mL样品提取缓冲液：2.5mL0.5mol/LTris-HCl3.-20下预冷丙酮(含0.07%-巯基乙醇)4.-20预冷的80%丙酮(含0.07%-巯基乙醇)实验四 琼脂糖电泳技术实验目的通过本实验学习和掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术实验原理在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有下列优点：（1）琼脂含液体量 大，可达98-99%，近似
27、自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。（2）琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。（3）电泳速度快。（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。（5）区带易染色，样品易回收，有利于制止备。然而琼脂中有较多硫酸根，电渗作用大。琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。琼脂（糖）电泳常用缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。离子强度过高时，会有大量电流通过凝胶，因而产生热量，使凝胶的水份量蒸发，析出盐的结晶，甚至可使凝胶断裂，电流中断。常用的
28、缓冲液有硼酸盐缓冲液与巴比妥缓冲液。为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液，混匀后再用。天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。（1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。（2）琼脂糖
29、凝胶结构均匀，含水量大（约占98%99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力
30、高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和纯化DNA片段一种方法和技术。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相
31、对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分于质量相同，但构型不同的DNA分子。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系琼脂糖凝胶的百分浓度（%）分离线状DNA分子的有效范围（kb）0.36050.62010.7100.80.970.51.260.41.540.22.030.1Amount of Agaros
32、e and TBE buffer for Typical Gel Sizes and Electrophoresis ParametersAgarose concentrationGel sizeAgarose1 TBE bufferSample volume/wellElectrophoresisVoltmATime0.7% for Genomic DNA.68cm0.17g25ml10l15-2015h1114cm0.52g75ml20l15-2015h1120cm1.05g150ml20l15-2015h2025cm2.10g300ml20l15-2015h1.5% for fragme
33、nts from 200 to 3500bp such as STSs.1114cm1.12g75ml20l25-301224cm2.25g150ml18l25-302025cm3.00g200ml20l25-302424cm4.50g300ml16l25-302% for RAPDs.1114cm1.12g75ml20l35-401224cm2.25g150ml18l35-402025cm3.00g200ml20l35-402424cm4.50g300ml16l35-403% for fragments below 400bp such as plasimds, probe inserts
34、or SSRs (Proportion of Metaphor agarose:Seakem agarose=2:1 or 1.5:1.5 for fine separation and resolution).1114cm2.25g75ml20l1002-3h1224cm4.50g150ml18l1002-3h1224cm3.60g120ml12l1002-3h2025cm6.00g200ml20l1002-3h2424cm9.00g300ml16l1002-3h试剂配方1. 10TBE, 但电泳时采用工作液位0.5 TBETable 5.2 10 TBE Gel Buffer (0.9 M
35、 Tris, 20 mM EDTA)Stock1 Liter3 Liter5 LiterTris base (MW=121.10)108.0g324.0g540.0gBoric Acid (MW=61.83) 55.0g165.0g275.0g0.5 M EDTA pH 8.0 40.0ml120.0ml200.0ml* pH to 8.0 with glacial acetic acid. A precipitate may form when stored for long periods of time.2. 凝胶载样缓冲液： 0.25%溴酚蓝，40%（m/V）蔗糖水溶液, 4保存pro
36、tocols:15. Melt agarose in microwave oven, keeping covered to avoid evaporation and mixing vigorously several times during heating. Make sure all the agarose is dissolved (it takes longer to dissolve than lower concentrations). The solution surface can be marked before heating and add dH2O up to the
37、 mark after heating, or weigh again after heating and make up for the evaporated weight with dH2O. Heat up one more time. 16. Apply some vacuum to the flask containing the agarose solution to eliminate very small bubbles created by much mixing.17. Cool to about 55 (if desired, the flask can be place
38、d into cool water to speed cooling), pour agarose solution right away into gel tray with taped ends and insert combs and leave it to solidify (20-30min). It could be cooled at 4 for 15 min before loading samples. We often prepare such gels one day ahead and keep them covered with Saran Wrap at 4.18.
39、 Remove tapes, place tray in electrophoresis rig and pour enough 0.5 TBE buffer (table 5.2) in to cover the gel by at least 0.5 cm. Remove combs only when ready to load samples.19. Run samples into gel according to the parameters in table 2.3 until the bromophenol blue dye has migrated to just above
40、 the next set of wells. You may run gel at a higher rate, however resolution of the samples may suffer. Resolution can be improved by recirculating the buffer.20. Remove tray from rig and stain in 1g/ml ethidium bromide (100l of 10 mg/ml ethidium bromide in 1000 ml dH2O) for 20 min with gentle shaki
41、ng. CAUTION: Ethidium bromide is extremely mutagenicwear a lab gown and double gloves when handling and use extra precaution.21. Rinse gel in dH2O for 20 min, slide gel onto a UV transilluminator and photograph. For Fotodyne PCM-10 camera with 2026 cm hood and Type 667 Polaroid film use an f8 or f5.
42、6, 1sec exposure. For Fotodyne MP-4 camera Type 665 Polaroid (negative) film use an f8 or f5.6, 2 min exposure.注意事项1琼脂糖凝胶电泳时加样侧应位于负极端。2溴乙锭可引起基因突变，操作时要注意个人防护。3紫外光对人眼有害，观察时加盖玻璃罩，观察时间不宜太长。实验五 PCR基因扩增及其影响因素分析实验目的了解聚合酶链式反应的原理。掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公
43、司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系
44、相对较简单。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。材料Amplify core sequence of Bt gene from genomic DNA of transgenic maize plant and plasmid (CK) with the method of polymerase chain reaction.实验步骤22. On ice, in 0.2 ml centrifuge tube, add:StockFor 20 l