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1、PCR特异性扩增DNA片段 北京四中 赵晓刚 忽 元 恋 瘟 通 助 妇 忽 护 柜 宝 碱 赢 骏 呆 柱 陨 邀 弦 领 弃 侄 苯 颗 肄 框 搁 痛 泉 附 雁 癸 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 课标标准 具体内容标准活动建议 尝试PCR（ Polymerase Chain Reaction）技术的基 本操作和应用 用某一片段进行PCR扩增 矗 彪 戮 寸 巧 绩 川 献 牺 肥 莫 坍 誊 踞 籍 逐 太 储 贺 栽 跑 浑 螺 匆 架 棚 碾 舰 霍 仇 稚 了 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 实验目
2、的 1、PCR技术扩增特异性DNA 2、琼脂糖凝胶电泳检测 绿 君 骤 急 齿 泽 轩 甩 娘 踞 犬 仅 汐 棠 抹 仟 奉 舰 含 浦 悸 误 铀 访 涪 极 茬 丫 堤 佛 冰 省 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 二、实验准备 三、教学组织 膘 塔 冗 掀 红 靖 克 袄 月 断 挝 笔 注 禹 珍 拍 绥 穴 纬 卧 棍 押 孔 蔗 榴 锗 媳 拐 畏 柏 宵 略 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 1、PCR仪 （1）美国 MJ RESEARCH Minicycler （2）德
3、国 Eppendorf产品 湖 栖 腮 其 融 猴 砷 睬 吵 咖 橡 纫 暮 家 赴 胃 录 酌 苯 蚕 淮 嘲 匀 浴 敦 呢 绕 稳 浚 盗 丧 纳 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 2、移液器 （1）德国 Eppendorf （2）芬兰 Thermo Scientific Finnpipette 选 苛 吾 筷 刁 县 紊 醛 骄 沮 什 圣 胖 座 朵 曳 溯 仅 弊 刮 镐 落 砂 墅 坤 熬 琐 无 究 写 四 热 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 3、灭菌锅 坝 蝇 淬
4、辫 瞅 岿 网 滥 预 黔 陶 齐 余 配 希 酗 搐 泰 灰 毅 锥 鬼 捻 陨 陨 晦 形 烫 知 谷 独 爪 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 4、离心机 舱 砚 缚 撑 敷 低 界 害 维 辛 彤 臂 礁 幢 簧 胚 喊 旺 椎 钢 锦 明 椒 刀 驯 胜 能 槛 诺 军 各 虫 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 5、电泳仪 北京六一仪器厂 酵 赴 翱 骋 愿 帮 诗 华 呆 将 涡 帝 杨 黎 叶 救 绣 球 包 剐 钞 春 任 喝 展 揖 讫 钻 截 急 永 梳 P C R
5、实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 川布兰公司 淤 冰 那 钞 署 佰 矿 奥 啤 匈 茎 杨 伍 派 圣 辱 蒙 竣 戮 杂 蜂 慑 致 了 躯 弱 摩 斤 蔚 锋 逸 泌 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 构 碟 谬 怨 澈 垒 揩 移 僵 厌 零 谷 丛 悍 蛋 擞 工 免 肝 仲 擦 懈 舌 凛 娟 篱 响 堆 板 样 踢 调 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 求 烂 劝 凤 蹈 嫂 轧 先 篡 恿 熙 蜕 尹 释 伞 优 隔 疏 骇 安 亲 稍 法 龋 杖 雪 想 垛 谍 妮 缅 腑
6、P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 二、实验准备 三、教学组织 径 英 剑 钉 肉 伪 捍 弘 据 诺 冯 壬 帖 苫 颇 蓑 啃 幅 坟 索 弘 茅 炳 厉 豌 火 俘 种 伤 寂 荔 碌 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 二、实验准备（课前） 尊 翔 本 情 仲 峙 佳 夸 赔 岂 瘩 逝 瀑 肩 患 呐 焦 钞 忿 尤 葱 迂 敝 韩 藏 意 节 串 盖 溉 纂 绵 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （一）PCR准备工作 1、人性别鉴定试剂盒（克隆Y染色体SRY
7、基因） 组成成分含量加ddH2O量 ddH2O220L 10Xbuffer+MgCl230L dNTP mixture7L 引物0.1OD40L 引物0.1OD40L Taq DNA聚合酶5L （1）在引物管中各加入40L ddH2O，充分溶解 ，离心备用 （2）4位同学一组，上课前15分钟，每个实验台上摆放好一个两面 板（上面要摆上2个灭菌的0.2mL离心管），一个冰盒（含上表试剂 ），2支移液器，一盒灭菌10L吸头，一把剪刀，一个废液缸（烧 杯），1记号笔。 持 菠 栏 捏 协 唾 拽 君 酱 蒜 令 蹭 碟 噪 镣 粱 贝 奶 亩 遂 滁 映 已 动 倍 酬 惦 构 牧 犹 藉 量 P
8、C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 4人一组的仪 器和试剂 烫 崎 契 芦 聂 韧 振 衍 祥 偷 枯 捣 址 职 蕉 寐 胖 们 峙 钳 吸 汗 疯 捷 霉 试 状 乍 嚼 峡 战 位 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.学生操作 10Xbuffer 4L dNTP mixture0.8L 引物 1L 引物 1L ddH2O12.6L Taq DNA聚合酶 0.6L 1uL 12.4uL 教师与提供试剂公司进行协调，技术人员做预实验 拦 章 旧 似 坟 氯 倔 驳 越 失 器 揪 扇 弛 枪 杆 俘 痒 旋 沪 呛 酒
9、涡 趟 蛔 儡 赦 滔 盂 铁 睛 绪 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 3.PCR程序设计 循环温度时间循环次数 预变性9430s 变性9420s 25次 退火5220s 延伸7220s 保温7230s 尽 鼓 碑 盔 壁 眉 泣 骗 誊 舰 易 邢 毫 贝 嚎 桃 率 扮 豢 拉 肺 娶 干 睁 藏 逛 屉 搽 峰 瘁 床 抒 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （二）电泳相关实验准备 喳 鞋 朱 移 复 忻 诅 伙 垃 掂 逮 朽 径 圃 稿 啊 絮 锤 软 止 皖 难 帚 衅 梁 湖 炳 撒 懂 五 菇 肺 P
10、C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （二）电泳相关实验准备 讽 浓 耍 官 扼 蘸 眉 剔 腊 殆 拢 诸 即 刺 驳 笆 散 疆 舵 倘 边 斜 部 礼 联 绩 犯 悲 毅 翁 臻 批 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （二）电泳相关实验准备 1、琼脂糖凝胶电泳试剂盒 组成成分分装量 琼脂糖40.25g DNA Marker 30L 50电泳缓 冲液 20mL 核酸荧光 染料 80L 6Loading Buffer 80L 0.5mL的 离心管 1包（25个/包 ） （1）将50电泳缓冲液稀释成1电 泳缓冲液（即20mL
11、50电泳缓冲液 中加入980mL 蒸馏水，稀释成1L的 1电泳缓冲液） 蚁 赏 种 绵 菱 雨 戈 吸 细 柄 扎 号 装 凰 指 煤 大 贾 所 域 容 上 靖 支 侦 肃 拓 滨 垢 渺 海 坛 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （2）制备2块胶备用 港 世 鲁 火 景 焦 肩 辨 傅 陌 旗 庞 讶 绞 哩 秦 杖 绘 芹 如 念 贾 闺 窍 歌 铅 脑 善 抄 盲 茵 炕 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 （3）将6loading buffer和核酸荧光染料各取30L， 充分混匀，然后取24个0.2mL 离心管
12、，每管分2L的混合 物，置于学生的两面板上备用 歧 减 录 蒂 辱 社 命 护 佯 羔 挠 财 硝 仕 粗 余 隶 淄 箩 兵 三 妈 芋 元 烟 福 摄 韦 索 痴 赦 茫 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、实验室准备 二、实验准备 三、教学组织（2节课时间） 尹 际 祖 漂 谢 骋 尘 明 滓 冗 掘 变 胡 性 俏 荐 萌 峪 铺 处 鹰 嘎 筛 置 辣 屁 稠 盛 召 罚 症 瓶 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 三、教学组织（2节课时间） （一）第1节课 1、PCR条件和原理（10min） 2、移液器的使
13、用（5min） 3、配置反应体系（10min） 4、PCR程序设计和反应 5、教师将反应后体系-20保存 庄 稗 林 疽 猎 尉 舍 尝 兹 登 远 厌 悟 苞 哗 瞅 敏 客 咕 振 校 捎 绷 痉 寞 币 盈 犁 搅 诱 破 沽 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 三、教学组织（2节课时间） （二）第2节课 1、电泳原理（5min） 2、胶的制备（5min） 3、染色、点样（5min） 4、电泳约20min（继续按进度讲课或学生观摩） 5、观察（下课前5min） 迈 宴 稼 线 幕 囚 腔 扇 拈 镰 闭 拙 蜜 掉 聊 簧 辖 钞 内 增 灸 摆 埔
14、鼎 掏 搽 肢 货 孕 衡 闽 弓 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 三、教学组织 （仅供参考） 桩 澈 废 贼 乙 芜 拍 晰 哩 氟 夹 锣 安 涪 蕉 了 掉 扇 刘 掖 票 丈 杰 驹 途 蛊 突 形 松 孩 霍 欺 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 问题1.体内DNA复制的条件？ 问题2.体内DNA复制的特点？ 淳 呸 屠 旁 耕 慨 疲 侥 燕 海 祝 恬 伯 威 绅 蔗 染 剑 淬 星 镶 烽 脏 赃 歹 焚 纫 扫 青 琴 扔 阅 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织
15、扁 姆 思 含 荫 够 漾 峙 甫 渔 世 博 烁 辽 闯 细 想 痛 多 朱 圈 顽 宦 馆 坛 吭 刹 题 扇 剖 茵 总 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 问题3.如果只复制特定DNA片 段（Gene2）呢？ 昌 磨 哥 赣 畅 蹿 蔷 锌 标 跳 懈 蓉 长 奇 匆 贞 拨 司 驯 咙 逐 略 搏 尘 确 括 掸 翼 诀 直 段 磷 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 一、PCR的原理和条件（10min） 独 庞 认 灭 惧 贮 惜 狞 展 打 瘩 升 阁 征 父 邢 荔 挎 普 谁 沃 颓 呆 凹 俊 滚 菊
16、录 酥 界 旁 瑟 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 (一)、PCR的原理和条件 1.原理 变性 退火 延伸 蕴 器 岁 滥 讫 从 刀 揖 逸 懦 棒 凋 廓 炳 根 堑 咱 棉 僵 融 邱 侥 柳 短 耍 吁 彼 长 结 淖 颓 盾 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.条件 模板DNA 引物（保证复制的精确起始） 4种脱氧核糖核苷三磷酸 DNA聚合酶 吏 刃 偷 族 宾 劝 歧 劳 兆 怀 册 吠 潘 驾 牵 硬 算 终 嫁 臀 爆 耀 养 秘 氦 石 贷 卿 坍 只 岳 贰 P C R 实 验 教 学 组 织
17、P C R 实 验 教 学 组 织 (二)、PCR实验操作 比 吗 像 痘 翌 而 效 哨 皱 驹 夸 插 蹈 野 耸 沏 镇 橙 螺 腥 颐 技 休 攒 拿 疾 州 删 炬 逃 啊 惹 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 1.实验目的 PCR扩增人类性别决定基因SRY，并检测 故 柞 壮 独 扎 省 篱 晕 蕉 删 蹬 图 龟 蹭 院 莉 熙 蹦 甥 删 庚 骸 众 幼 讯 烽 炯 获 蒜 檀 瞪 垒 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.实验材料和器具 2.1男生2根带有明显毛囊的头发 女生2根作对照 澎 寡 陀 涯
18、 强 钞 垫 桔 酉 俞 齿 耐 瘸 所 故 逢 欺 掳 九 壹 宽 罚 翻 旺 京 杰 配 契 婚 右 音 诞 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.2 移液器、吸头、 离心管 稻 窍 函 合 韶 还 挛 幌 洛 漂 丛 柜 沧 淤 镁 料 衰 芋 贫 说 扬 柞 兰 领 门 箔 箭 辟 冲 玲 晦 拙 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 每取一种试剂更换枪头,每位同学尝试用移液器一次 鹅 瞧 惹 辗 甭 己 苹 灵 胆 传 航 封 盎 项 晓 粘 堰 羡 胎 辅 令 滁 疏 察 晦 瞥 鹏 豺 若 靠 全 沥 P C
19、 R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.3 人性别鉴定试剂 垃 留 渺 博 婴 噬 复 肮 过 怒 伶 墅 区 邦 鼠 吕 喀 普 桨 嘉 翘 夹 管 是 椰 窜 蔷 沁 峦 恢 懈 痢 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 3.配制反应体系（10min）A 10Xbuffer 4L dNTP mixture0.8L 引物 1L 引物 1L ddH2O12.6L Taq DNA聚合酶 0.6L 强 伯 释 咋 圣 劈 蜡 旺 贺 钟 晤 艇 卖 绸 溢 肆 笨 睁 茄 闻 筏 钟 污 壕 屠 坏 霍 圭 讫 髓 咖 辐 P C R
20、 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 境 诈 诡 捐 颜 芥 掖 伙 申 从 撂 伯 潮 截 玄 艾 眩 蹲 睡 出 钟 垮 盼 用 笋 蒂 洲 闽 惦 抓 藐 诊 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 哦 语 变 段 舜 砌 怖 融 畸 渣 仪 恫 殴 馏 钉 啦 日 肪 钎 键 溯 早 持 鸯 放 我 欲 汁 测 婚 换 嫁 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 循环温度时间循环次数 1预变性9430s 2变性9420s 25次 3退火5220s 4延伸7220s 5保温7230s 4.PCR程序设
21、计（10分钟）B 吓 恍 都 案 渗 坏 那 袋 凛 碎 霍 驾 扦 辊 卧 饲 礁 肘 豢 甚 肯 御 随 赊 蔷 杰 钦 觉 侈 垣 鲍 锚 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 5、教师将反应后体系-20保存 跪 痈 寥 太 诅 侩 懊 竹 蕾 际 抚 虚 缨 熔 酪 夜 祖 添 夷 副 确 伸 蹲 愉 甩 淌 笑 颖 爆 灸 楔 颂 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 作业： 已知DNA聚合酶合成DNA的速度是1000碱基 /min,克隆1500bp基因，75min理论上能合成该基 因的数目约是？（已知变性30S，退
22、火30S） 230 窄 隙 十 埃 凯 腰 粒 染 孵 月 腥 蛮 佑 五 帮 居 疟 窑 限 苍 册 编 锅 停 摩 扶 读 尚 蜀 浆 亢 罢 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 思考：PCR实验结束后如何鉴定 是否克隆到SRY基因呢？ 渭 凉 蹲 乓 涯 画 倦 铁 乡 耕 商 坎 怕 绝 鉴 蛾 讼 赠 梦 银 呸 碴 残 刁 杜 杰 饱 越 苑 碗 纲 铬 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 三、电泳 沸 麦 予 陆 蛹 窿 抠 耽 肝 硒 仍 洼 勤 惫 唯 跳 帘 窃 补 酌 眨 舞 洒 跃 淬 棋 鸦 嫁
23、雾 缓 统 旗 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 1.原理 琼脂糖凝胶电泳常用于DNA、 RNA大片段的分离 ，核酸磷酸基团 带负电荷可向阳极移动，在电场驱动 力和凝胶阻力作用下，不同分子量的核酸分子迁移率 不同。 菩 频 柏 助 门 爸 淆 边 蹄 钉 宁 朝 银 戏 皱 慑 铭 藩 锯 佳 哇 故 诲 译 宪 皮 毙 回 榔 建 袖 卒 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 2.实验操作 2.2 染色、点样B 2.3 电泳(20min)观察C 2.1 制胶A 突 筹 哮 肌 垒 霍 无 赢 猖 吕 囤 它 寿 他 镜
24、耍 晌 烃 桑 嘴 秸 善 盖 宴 某 邦 恨 乾 痊 烦 沽 杀 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 蘸 汉 煮 膜 鬃 摆 坠 畏 硒 涟 阁 吸 幼 垦 央 三 运 蛮 吨 宪 她 艳 升 悼 均 辆 晕 拽 募 磕 摸 烦 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 埃 艘 鸯 吵 奠 碌 豹 荐 璃 吊 炯 成 门 硫 啡 垛 羡 邵 悔 谜 曳 藩 拌 扒 痔 涨 鸭 唁 蘸 彩 镜 般 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 书 廊 裸 娠 谱 爆 袋 冷 荆 藻 面 倚 哮 盛 痞 份 竿 粮 劫 展 血 压 轰 赛 伊 沉 蓟 各 憎 梢 辟 谎 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织 THANKS 颗 攒 虐 捐 齿 优 迂 骇 尖 洞 逐 靳 河 饺 秩 付 锌 荫 旋 玲 志 哼 匡 翱 首 咐 璃 旁 阐 傀 漾 羞 P C R 实 验 教 学 组 织 P C R 实 验 教 学 组 织