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1、目目 录录第九章第九章酶活力及其动力学常数的测定酶活力及其动力学常数的测定目目 录录n酶是具有催化活性的蛋白质酶是具有催化活性的蛋白质 n酶学研究是现代分子生物学不可缺少的内容。酶学研究是现代分子生物学不可缺少的内容。目目 录录酶学研究的意义表现在酶学研究的意义表现在 n研究酶结构和功能的关系，研究酶结构和功能的关系，n分析酶的改变和疾病的关系分析酶的改变和疾病的关系 n研究酶在发育及分化中的作用，研究酶在发育及分化中的作用，n酶标已成为现代分子生物学研究常用的工具酶标已成为现代分子生物学研究常用的工具 n由于酶是其基因表达的产物由于酶是其基因表达的产物 n对酶工业的指导作用对酶工业的指导作用
2、 目目 录录第一节第一节 基本概念基本概念n一、酶活力一、酶活力n指酶的催化活性。一般用国际单位表示。第五指酶的催化活性。一般用国际单位表示。第五届国际生化会议推荐：在一定条件届国际生化会议推荐：在一定条件(温度和温度和pH)下，下，1分钟转化分钟转化lmol底物所需的酶量为一个底物所需的酶量为一个酶单位酶单位(1U)目目 录录n二、酶的比活力二、酶的比活力n指每毫克蛋白中含有的酶活力单位数，用指每毫克蛋白中含有的酶活力单位数，用IU(U)/mg表示。酶的比活力是酶浓度和酶质表示。酶的比活力是酶浓度和酶质量的衡量标准量的衡量标准 n 三、酶的转换常数三、酶的转换常数 n分子活性：每摩尔酶分子、
3、每分钟转换底物分子活性：每摩尔酶分子、每分钟转换底物的摩尔数的摩尔数n催化中心活性：每摩尔活性亚基或催化中心催化中心活性：每摩尔活性亚基或催化中心每分钟转换底物的摩尔数每分钟转换底物的摩尔数目目 录录n 四、四、KmnKm是酶活性部位的一半被底物占据或酶反应是酶活性部位的一半被底物占据或酶反应达到最大反应速度一半时所需要的底物浓度，达到最大反应速度一半时所需要的底物浓度，是一定温度下酶的特征常数，又称米氏常数。是一定温度下酶的特征常数，又称米氏常数。同一酶的不同底物有不同的同一酶的不同底物有不同的Km。n 1/Km表示酶底亲和常数，表示酶底亲和常数，1/Km愈大，则愈大，则亲和力愈大亲和力愈大
4、 目目 录录n五、五、V及及Vmn V是反应速度。指单位时间内是反应速度。指单位时间内(如如1分钟分钟)每毫每毫克酶蛋白转换底物的克酶蛋白转换底物的mol数数nVm表示在一定酶浓度和反应条件下的最大反表示在一定酶浓度和反应条件下的最大反应速度，是底物浓度足够大时，酶反应速度趋应速度，是底物浓度足够大时，酶反应速度趋向的极限值向的极限值 目目 录录 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。第二节第二节 酶活力的测定方法酶活力的测定方法 目目 录录一、底物浓度对反应速度的影响一、底物浓度对反应速度的影响研究前提研究前提v 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反
5、应在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈速度的影响呈矩形双曲线关系矩形双曲线关系。当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。应为一级反应。目目 录录随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。为混合级反应。目目 录录当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应反应为零级反应目目 录录目目 录录（一）米曼氏方程式（一）米曼氏方程式酶促反应模式酶促反应模式中间产物学说中间产物学说E+S k
6、1k2k3ESE+P目目 录录S：底物浓度底物浓度V：不同不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant)VmaxS Km+S 目目 录录（二）（二）Km与与Vmax的意义的意义目目 录录目目 录录（三）（三）m m值与值与maxmax值的测定值的测定目目 录录二、酶浓度对反应速度的影响二、酶浓度对反应速度的影响0 V E 当当SE时，时，Vmax=k3 E 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响 目目 录录三、温度对反应速度的影响三、温度对反应速度的影响q最适温度最适温度 (
7、optimum temperature)：酶促反应速度最快时的酶促反应速度最快时的环境温度。环境温度。*低温的应用低温的应用酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度温度 C 温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响 目目 录录四、四、pH对反应速度的影响对反应速度的影响q最适最适pH (optimum pH)：酶催化活性最大酶催化活性最大时的环境时的环境pH。0酶酶活活性性 pH pH对某些酶活性的影响对某些酶活性的影响 246810目目 录录二、酶活力的测定方法二、酶活力的测定方法 n(一一)总则总则 n有可被检测且能反映酶反应进行程度的信号物有可
8、被检测且能反映酶反应进行程度的信号物n底物对酶远远过量底物对酶远远过量(通常底物浓度为通常底物浓度为Km的的3l0倍倍)n适宜的反应温度适宜的反应温度n最适最适pH反应体系反应体系n被测的酶量适当被测的酶量适当 目目 录录n(二二)酶的测活方法酶的测活方法 n1静态法静态法：n在一定条件下将酶和底物作用一定时间后终止在一定条件下将酶和底物作用一定时间后终止反应，然后直接或间接地检测底物的减少反应，然后直接或间接地检测底物的减少(或或产物的增加产物的增加)量，从而计算出酶的活力量，从而计算出酶的活力 目目 录录此法测活的关键步骤是反应多长时间后终止反应此法测活的关键步骤是反应多长时间后终止反应
9、为解决这一问题，首先应在较高酶浓度下启动反应为解决这一问题，首先应在较高酶浓度下启动反应(曲线曲线3)，于不同的反应时间终止反应，然后作出产物浓度一时间曲线于不同的反应时间终止反应，然后作出产物浓度一时间曲线找出产物随时间线性增加的最长时间找出产物随时间线性增加的最长时间t。在正式测活中，选用低于此酶量的样品，反应到在正式测活中，选用低于此酶量的样品，反应到t。(或小于或小于t。)时终止反应时终止反应即可得到正确的酶活性即可得到正确的酶活性 目目 录录n2半动态法半动态法n于不同时间分别从反应体系中取出一定量的样于不同时间分别从反应体系中取出一定量的样品，迅速置于反应终止液中，然后通过检测并品
10、，迅速置于反应终止液中，然后通过检测并计算反应后不同时间样品中的底物减少量计算反应后不同时间样品中的底物减少量(或或产物增加量产物增加量)，从而计算出反应速度。，从而计算出反应速度。目目 录录本实验中的时间点间隔根据实验确定。本实验中的时间点间隔根据实验确定。一般是酶活性高，时间间隔短；酶活性低，间隔可适当延长。一般是酶活性高，时间间隔短；酶活性低，间隔可适当延长。选用的时间点一般以选用的时间点一般以35点为宜点为宜 目目 录录n 3动态法动态法 n该法连续监测酶反应进行的程度，同时记录不该法连续监测酶反应进行的程度，同时记录不同时间点产物生成同时间点产物生成(或底物减少或底物减少)量，然后计
11、算量，然后计算出单位时间内产物的增加出单位时间内产物的增加(或底物的减少或底物的减少)量即量即酶活力，再计算出其比活力。酶活力，再计算出其比活力。目目 录录n4.偶联酶法偶联酶法 n许多反应的底物或产物不能直接被检测许多反应的底物或产物不能直接被检测 n两种方法解决：两种方法解决：n在反应终止后，加入一种新的物质，其可以和产物在反应终止后，加入一种新的物质，其可以和产物(或底物或底物)反应，生成可被检测的物质反应，生成可被检测的物质(如有颜色的物如有颜色的物质、荧光物质等质、荧光物质等)而间接测出产物而间接测出产物(底物底物)的改变量的改变量n可将第一步酶反应的产物作为第二步酶反应的底物，可将
12、第一步酶反应的产物作为第二步酶反应的底物，通过第二步酶反应生成可检测的产物，通过检测第二通过第二步酶反应生成可检测的产物，通过检测第二步反应产物的变化计算出第一步底物步反应产物的变化计算出第一步底物(或产物或产物)的改变的改变量，从而计算出催化第一步反应的酶活力量，从而计算出催化第一步反应的酶活力n此法即为偶联法。此法即为偶联法。目目 录录第三节第三节 同工酶的测活同工酶的测活 n总的原则是：抑制或除去其余同工酶，保留被总的原则是：抑制或除去其余同工酶，保留被测酶，然后再测出目的同工酶的活性测酶，然后再测出目的同工酶的活性 n 一、热失活法一、热失活法n二、特异性抑制剂法二、特异性抑制剂法 n
13、加入特异性的抑制剂或变性剂，可抑制特定的加入特异性的抑制剂或变性剂，可抑制特定的同工酶同工酶 目目 录录n三、选择性底物法三、选择性底物法 n不同的同工酶对某些底物的选择可能具有特异不同的同工酶对某些底物的选择可能具有特异性性 n 四、柱层析法四、柱层析法 n将同工酶一一分离测其活力将同工酶一一分离测其活力 n五、电泳法五、电泳法n六、免疫法六、免疫法 n抗体可以和特定的同工酶结合而抑制或沉淀该抗体可以和特定的同工酶结合而抑制或沉淀该同工酶同工酶 目目 录录第四节第四节 Km及及Vm的测定的测定n测定酶的测定酶的Km及及Vm是酶动力学研究的重要内容是酶动力学研究的重要内容n 一、一、Linew
14、eaver-Burk作图法的原理作图法的原理 n米氏方程米氏方程 目目 录录n将方程两边取倒数将方程两边取倒数 目目 录录目目 录录n如果固定酶和其中一个底物的量，在另一底物不同浓度下如果固定酶和其中一个底物的量，在另一底物不同浓度下测活，得到酶反应速度，用双倒数作图，则很容易求出酶测活，得到酶反应速度，用双倒数作图，则很容易求出酶对该底物的对该底物的Vm及及Km。n选择使用底物时选择使用底物时 n1应选择应选择V-S曲线中的线性部分对应的底物浓度。曲线中的线性部分对应的底物浓度。n2由于是双倒数作图，故选择由于是双倒数作图，故选择S时，最好选用时，最好选用1S呈常数递增的数值，呈常数递增的数值，n3理论上分析，理论上分析，SKm时，测定时，测定Km及及Vm最准确，最准确，目目 录录