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1、1、基因工程至少需要哪三种工具？,2、这三种工具分别起什么作用？,温故知新：,1.2 基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,问题1,一：目的基因的获取,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,1.目的基因主要是指_,编码蛋白质的基因,什么是目的基因,？,2、也可以是具有调控作用的因子,获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因 3、人工合成
2、目的基因,未知序列,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库概念,2.基因文库类型,（包含一种生物的所有基因）,（包含一种生物的一部分基因）,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。,(一)从基因文库中获取目的基因,3.基因组文库的构建,提取某种生物的全部DNA,用适当的 限制酶,一定大小的DNA片段,将DNA片段 与
3、载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,4.cDNA文库的构建,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体 连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA 聚合酶,导入受体菌 中储存,反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,cDNA合成过程是： 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA 互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链 降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合
4、酶的作用 下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,问题2,为什么用生物发育某个时期的mRNA反转录得的DNA只有这种生物的部分基因？,某个时期的发育是基因选择性表达的结果,两种基因文库的主要区别如下表（课本P10）,总结,1、概念：PCR全称为_，是一项在生 物_复制_的核酸合成技术,3、条件：,2、原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,(二)利用PCR技术扩增目的基因,模板,（目的基因）,原料(脱氧核苷酸),引物（一小段单链DNA）,DNA聚合酶（耐高温）,温度控制,4、操作前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。,6、结果 。,5、扩增形式：,指
5、数形式（2n）,在短时间内大量扩增目的基因,7、过程：,a、变性（90-95）：双链DNA模板在热作 用下，_断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物开始进行碱基互补配对，合成与 模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,(二)利用PCR技术扩增目的基因动画演示,细胞内复制 .VS. PCR扩增,DNA母链,4种脱氧核苷酸,Taq DNA聚合酶,引物（2个snDNA）,温度控制,1）模板： 2）原料： 3）酶：,DNA母链,4种脱氧核苷酸,解旋酶 DNA聚合酶 引物酶 DNA连接酶,D
6、NA增殖,4）特点:,半保留复制 边解旋边复制,(不用DNA连接酶),半保留复制,全解旋再复制,（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因,DNA合成仪,推测,推测,合成,前提：基因比较小、核苷酸序列已知,蛋白质的氨基酸顺序,mRNA核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,问题4,3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_,获取目的基因的三种方法应用,1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用_,2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用_,PCR技术扩增,化学方法人工合成,从基因文库获取的方法,二：基因表达载体的构建基因工程的核心,1,目的： 使目的基因在受体
7、细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，RNA聚合酶识别和结合的部位 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,3.基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口 四个黏性末端,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口 两个黏性末端,跟踪训练 (2012年江苏无锡高二检测)如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是( ),A基因工程的核心步骤是基因表达 载体构建
8、 B任何基因表达载体的构建都是一 样的，没有差别 C图中启动子位于基因的首端，是 RNA聚合酶识别和结合的部位 D抗生素抗性基因的作用是作为标 记基因，用于鉴别受体细胞中是 否导入了目的基因,B,三、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因导入受体细胞的方法,为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞？,全能性受限制,（1）农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,过程：,（2）基因枪法
9、：目的基因导入单子叶植物细胞,操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。, 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um 。,适用：单子叶植物,基因枪法,（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞, 特点:十分简便经济。,例：转基因抗虫棉（我国）,（4）、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,（5）、将目的基因导入微
10、生物细胞,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 常用菌：大肠杆菌 常用法：Ca2+处理获得感受态细胞 （改变细胞壁的通透性） 过程：,Ca2+处理 大肠杆菌,感受态 细胞,感受态细胞 吸收DNA,表达载体 与感受态 细胞混合,从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 【提示】 不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。,问题3,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少，且有的会摄入载体-载体，
11、目的基因-目的基因类型,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,问题4,问题5,练习,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 ( ) 将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导人细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵 A、 B、 C、 D、,C,检查是否成功,分子 水平,个体水平：,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫
12、鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,转基因生 物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的含有目的基因DNA片段,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物 的mRNA,14N,14N,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,（4）除上述分子检测外，有时还需进行 个体生物学水平的鉴定：如抗性特性,