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1、 河南科技学院新科学院河南科技学院新科学院 2014 届本科毕业论文届本科毕业论文 论文题目论文题目 超高压对胃蛋白酶酶解特性的影响超高压对胃蛋白酶酶解特性的影响 学生姓名：袁秋霞学生姓名：袁秋霞 所在院系：食品科学与工程系所在院系：食品科学与工程系 所学专业：食品科学与工程所学专业：食品科学与工程 导师姓名：马汉军导师姓名：马汉军 完成时间：完成时间：2014 年年 04 月月 20 日日 摘摘 要要 采用不同压力及保压时间处理酪蛋白进行酶解反应，首先以水解度、氮存 在形式及含量为测定指标，研究了高压处理对胃蛋白酶酶解酪蛋白的影响程度； 之后通过测定巯基、疏水键特征性指标，研究了高压处理对胃
2、蛋白酶酶解特性 的影响。结果表明 100MPa、15min 时，水解度最好为 11.1%，比未处理样水解 度 8.27%提高了 34.22%；100MPa、15min 时可溶性氮、肽基氮含量最低，氨基 氮含量最高，可溶性氮转化了部分氨基氮；酶解产物巯基含量、疏水性指标均 在 100MPa，15min 时最低，为 2.5978mol/g、1306.8So，说明高压改变了蛋白 质的三、四级结构。 关键词关键词: : 酪蛋白；超高压；酶解产物；酶解 Effects of Ultra-high Pressure on the Characteristics of Pepsin Digestion Ab
3、stract Different pressures and dwell time to deal with casein enzymatic hydrolysis reaction，first, the degree of hydrolysis，the presence of nitrogen in the form and content of measurement indicators, which studied the influence of high pressure treatment pepsin digestion of casein;then by measuring
4、the thiol group and hydrophobic bond characteristics index,which researched the effects of high pressure treatment on the characteristics of pepsin digestion.The results show the best degree of hydrolysis that the data of 100MPa, 15min are 11.1%,which improved 34.22% compared to the untreated sample
5、 the degree of hydrolysis 8.27%; It is the lowest which the content of soluble nitrogen and peptide-based nitrogen at 100MPa, 15min and the highest content of amino nitrogen, then soluble nitrogen into some amino nitrogen; it is the lowest which Hydrolysates sulfhydryl content and hydrophobicity ind
6、ex is 2.5978 mol/g, 1306.8So at 100MPa, 15min,which illustrated that high pressure changed three or four structural proteins. Key words:Casein; Ultrahigh pressure; enzymatic hydrolysate; Enzymatic 目录目录 引言.1 1 试验材料与方法1 1.1 试验材料1 1.2 仪器设备2 1.3 实验方法2 1.3.1 胃蛋白酶解液：2 1.3.2 超高压处理2 1.3.3 酶解反应2 1.4 指标的测定2 1
7、.4.1 酶解液水解度的测定2 1.4.2 氨基氮、可溶性氮和肽基氮含量分析3 1.4.3 巯基(SH)含量分析.3 1.4.4 疏水性测定3 2 结果与分析4 2.1 不同压力及保压时间对酶解液水解度的影响4 2.1.1 压力大小对酶解液水解度的影响4 2.1.2 保压时间长短对酶解液水解度的影响4 2.2 不同压力及保压时间对氮存在形式及含量的影响。5 2.2.1 不同压力对氮存在形式及含量的影响5 2.2.2 保压时间对氮存在形式及含量的影响5 2.3 不同压力及保压时间对巯基含量的影响6 2.3.1 不同压力对巯基含量的影响6 2.3.2 保压时间对巯基含量的影响6 2.4 不同压力及
8、保压时间对疏水性指标的影响7 2.4.1 不同压力对疏水性指标的影响7 2.4.2 保压时间对疏水性指标的影响7 结论.9 参考文献.11 致 谢.13 0 引言引言 酪蛋白具高的营养价值，是一种全蛋白，在牛奶中的含量能达到 80%，常 作为婴幼儿的代乳品1。但酪蛋白在胃中形成的凝块较大，易导致婴儿的消化 不良，此外，-乳球蛋白易引起婴儿的过敏反应等2。采用蛋白酶对牛乳蛋白 进行适度酶解可以提高蛋白质的利用率及生物价，避免了婴幼儿的不良反应。 酪蛋白经过酶解后，乳化性、凝胶性、热温度性均有提高3。此外，酪蛋白酶 解过程中，产生多种具有生理功能的活性肽4。 超高压技术是近二十几年来兴起的一项新技
9、术，有以下显著特点：首先， 在保持制品营养成分和风味的前提下，延长制品的贮藏期、提高安全性、改善 组织结构、调节酶活力等，是目前食品科学领域研究的一个热点5-7；其次，超 高压技术灭菌均匀，操作安全，且能耗少，无“三废”污染。超高压处理下， 蛋白质三、四级结构中的氢键、离子键和疏水键等非共价键被打开，使之变成 无秩序的肽链状态，而使得分子结构伸展而变得松散8。酶是一种特殊的蛋白 质，超高压处理能影响其结构和性质，从而影响酶对蛋白质的催化特性。经研 究发现：酶活性中心的基础是蛋白质的三级结构，较低压力可使常压下完整组 织中经常被隔离的酶和基质相接触，加速酶解反应的进行，从而暴露出更多结 合位点，
10、易于酶解反应的进行9。低的压力也可以通过解离蛋白，松散其蛋白 结构，从而暴露出更多结合位点，使一些在常压下受抑制的酶激活。Cheftel10 在研究高压对蛋白质的影响时发现：压力不仅可通过解链、离解或蛋白质水解 提高肉的嫩度，且可通过解链增加蛋白质食品对蛋白酶的敏感度，提高可消化 性和降低过敏性。本课题组前期的研究也发现：高压处理不仅可使肉类嫩化效 果得到较大的改善11-15，还可显著提高胰蛋白酶对肉类蛋白质的消化能力16， 表明该处理手段不仅可用于肉类蛋白的结构与功能特性改善，还可用于提高肉 类蛋白的酶解敏感性。 本实验的目的是通过单因素法确定不同的压力、保压时间作用，酪蛋白变 性特性，以水
11、解度为特征性指标，研究该蛋白在胃蛋白酶作用下，以高压处理 的胃蛋白酶水解酪蛋白，测定其酶解产物的水解度、不同氮形式（可溶性氮、 氨基氮、肽基氮）及含量，并通过对酶解产物中巯基含量、疏水性的分析，研 究了高压处理对胃蛋白酶酶解特性的影响，以期为进一步探索超高压促进胃蛋 白酶酶解的机理打下基础。 1 试验材料与方法试验材料与方法 1.1 试验材料试验材料 胃蛋白酶：上海晶纯生化科技股份有限公司，酶活力 1:15000；酪蛋白：北 1 京索莱宝科技有限公司。主要试剂：甲醛，盐酸，三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris） ，乙二胺四乙酸（EDTA）二钠，甘氨酸，尿素，5,5-二硫双-2-硝基 苯甲酸，三氯乙
12、酸，磷酸盐，1-苯胺基-8-萘磺酸等。实验中所用其他化学试剂 均为分析纯。 1.2 仪器设备仪器设备 超高压处理装置（包头科发公司） ；多功能真空包装机：山东省诸城市中鼎 机械；SHA-C 数显水浴恒温振荡器：江苏省金坛市华峰仪器有限公司；PHS-3C 型精密 pH 计：上海雷磁仪器厂；KjeltecTM8400 全自动凯氏定氮仪，FOSS Denmark；TU-1810 型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司； MULTIFUGE XIR 型冷冻离心机 Thermo German；ALPHA1-2LD 型冷冻干燥机， Christ German；凝胶色谱仪。 1.3 实验方法实验方法
13、 1.3.1 胃蛋白酶解液： 在测定前，胃蛋白酶溶于 pH1.5 的盐酸溶液，使浓度达到 2mg/ml，4冷 藏，等待高压处理或作为对照样。 1.3.2 超高压处理 酶溶液用聚乙烯塑料袋真空密封包装(50mL/袋)，置于4的冰箱中保存(待 用)。用不同压力(50、100、150、200MPa)及不同保压时间(5、10、15、20min) 处理酶溶液，对照样：未经高压处理的酶液。 1.3.3 酶解反应 将一定量的酪蛋白在磁力搅拌器上边搅拌边加入到处理过的酶溶液及对照 液中，制成底物浓度为10mg/ml的悬浮液，置于水浴恒温振荡器中55酶解 6h(反应体系的pH、酶浓度、底物浓度、酶解温度和酶解时
14、间已经过优化)。酶 解结束后沸水浴灭酶10 min使酶失活，冷却至室温后，4冷藏，测定其不同指 标。 1.4 指标的测定指标的测定 1.4.1 酶解液水解度的测定 甲醛滴定法测酶解液水解度的测定17,18，取蛋白酶解液5mL置于100mL容量 瓶中，定容、混匀后取20mL置于200mL烧杯中，加入60mL去CO2水，用0.05 mol/L标准NaOH溶液滴定至pH8.2。加入10mL甲醛溶液，混匀后再用0.05 mol/L 标准NaOH溶液继续滴定至pH9.2，同时用蒸馏水代替酶解液做空白对照。记录 所消耗的标准NaOH溶液的体积，计算水解度（DH） 。 2 (1) 试样中氨基酸态氮含量（X）
15、按下式进 行计算： 式中：X试样中氨基酸态氮含量，单位为克每百毫升（g /100mL） ； V1测定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积， 单 位为毫升（mL） ； V2试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位 为毫升（mL） ； V3试剂稀释液取用量，单位为毫升（mL） ； c氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L） ； 0.014与1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为克 （g） 。 1.4.2 氨基氮、可溶性氮和肽基氮含量分析 氨基氮含量测定：采用甲醛滴定法19。 可溶性氮含量测定：凯氏定氮法。 肽基氮含量测定：水解物上
16、清液中肽基氮含量占原料总氮量百分比，即水 解产物中可溶性氮含量与氨基氮含量之差。 1.4.3 巯基(SH)含量分析 参照Beveridge等SH分析方法20。 巯基含量分析：吸取0.5mL酶解液，加入2.5mL TrisGly8MUrea溶液， 再加入0.02mL DTNB溶液(4mg/mL用TrisGly缓冲液配制)，迅速混合后在 25下保温反应30min，用分光光度计测定它在=412nm下吸光度值(A412)， 同时测定空白值(以蒸馏水代替样品测定)。每组样测定3组，取平均值为最终结 果。计算公式如下： mol SH/g=73.53A412D/C 其中73.53=106/(1.36104)
17、，1.36104是Ellman试剂的摩尔消光系数；A412为 =412nm下吸光度值；D为稀释系数，这里D=6.04；C为样品的蛋白质最终浓 度，单位为mg/mL。 1.4.4 疏水性测定 %100%DH 总氮含量 氨基酸态氮含量 ）（ 100 /100V5 014.0c)V-V 3 21 （ X 3 采用ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)荧光探针法21，取酪蛋白的不同酶解液用 凯氏定氮法测定蛋白浓度，并用同一磷酸缓冲液逐步稀释(浓度约在0.005%0.1%之 间)后，取不同浓度样品液5.00mL，分别加入50L浓度为8mmol/L的ANS溶液 （采用0.01mol/L pH=7.0的磷酸缓冲液
18、配置） ，振荡，静置3 min，然后测定样品 的荧光强度(FI)。本实验中激发波长ex=338nm，发射波长em=496nm。以 荧光强度对蛋白质浓度作图，初始段斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数(So)。 2结果与分析结果与分析 2.1 不同压力及保压时间对酶解液水解度的影响不同压力及保压时间对酶解液水解度的影响 2.1.1 压力大小对酶解液水解度的影响 图图 1.1 压力大小对水解度的影响压力大小对水解度的影响 由上图可以看出，随着压力的逐渐增大，酪蛋白经超高压处理胃蛋白酶酶 解液产物，其水解度指标，呈现先上升后下降的趋势，且100MPa时达到最大 11.1% ，在100MPa到200MP
19、a间压力对酶解液的水解度影响趋于平缓，而在 50MPa到100Mpa间，酶解液水解度涨势明显。 2.1.2 保压时间长短对酶解液水解度的影响 4 图图 1.2 保压时间对水解度的影响保压时间对水解度的影响 由上图可以看出，在 100Mpa 最佳压力下，随着保压时间的逐渐增大，处 理的胃蛋白酶酶解液的水解度逐渐增大最后趋于平缓，且 15min 时达到最大， 为 11.1% ，在 15min 到 20min 间对酶解液的水解度影响趋于平缓，而在 5min 到 10min 间，酶解液水解度涨势明显。 2.2 不同压力及保压时间对氮存在形式及含量的影响。不同压力及保压时间对氮存在形式及含量的影响。 2
20、.2.1 不同压力对氮存在形式及含量的影响 图图2.12.1 压力大小对氮存在形式及含量的影响压力大小对氮存在形式及含量的影响 由上图可知，超高压处理胃蛋白酶酶解液产物，主要以可溶性氮、氨基氮、 肽基氮形式存在，其中随着压力的逐渐增加，可溶性氮及肽基氮含量呈现先下 降后上升的趋势，在100Mpa时含量最低；氨基氮含量一直处于不变的趋势，将 近占原料总氮量的10%。 2.2.2 保压时间对氮存在形式及含量的影响 5 图图 2.2 保压时间对氮存在形式及含量的影响保压时间对氮存在形式及含量的影响 由上图可知，经超高压处理的胃蛋白酶酶解液产物，主要以可溶性氮、氨 基氮、肽基氮形式存在，在最佳压力下，
21、其中随着保压时间的逐渐增加，可溶 性氮及肽基氮含量呈现先下降后上升的趋势，在15min时含量最低；氨基氮含量 一直处于不变的趋势，将近占原料总氮量的10%。 2.3 不同压力及保压时间对巯基含量的影响不同压力及保压时间对巯基含量的影响 2.3.1 不同压力对巯基含量的影响 图图 3.1 不同压力对巯基含量的影响不同压力对巯基含量的影响 由上图可以看出，经超高压处理的胃蛋白酶酶解液，其巯基含量指标，在 50Mpa到100Mpa内显著下降，且100Mpa时最低；在100Mpa到200Mpa内巯基含 量缓慢上升。由此可见， 高压改变了蛋白质的三、四级结构。 2.3.2 保压时间对巯基含量的影响 图图
22、 3.2 保压时间对巯基含量的影响保压时间对巯基含量的影响 由上图可以看出，在最佳压力下，酪蛋白酶经超高压处理的胃蛋白酶酶解 6 液产物，其巯基含量指标，随着保压时间的增大，其含量整体是下降的：其中 在0-5min和10-15min含量变化趋势较明显，呈下降趋势；在5min-10min和15- 20min含量变化较平缓，呈上升趋势。 由此可见， 高压改变了蛋白质的三、四 级结构。 2.4 不同压力及保压时间对疏水性指标的影响不同压力及保压时间对疏水性指标的影响 2.4.1 不同压力对疏水性指标的影响 图图 4.14.1 不同压力对疏水性指标的影响不同压力对疏水性指标的影响 由上图可以看出，随着
23、压力的增加，超高压处理的胃蛋白酶酶解液产物， 其疏水性指数指标，整体呈现先下降后上升的趋势，其中在0Mpa到50Mpa时缓 慢上升；在50Mpa到100Mpa内疏水性指数显著下降，且100Mpa时最低；在 100Mpa到200Mpa内疏水性指数显著上升。由此可见， 高压改变了蛋白质的三、 四级结构。 2.4.2 保压时间对疏水性指标的影响 7 图图 4.2 不同保压时间对疏水性指标的影响不同保压时间对疏水性指标的影响 由上图可以看出，在最佳压力条件下，随着保压时间的增大，经超高压处 理的胃蛋白酶酶解液产物，其疏水性指数指标整体呈现先下降后上升的趋势， 其中在0-10min和15-20min呈现
24、上升趋势；在10min到15min呈现显著下降趋势 ，且在15min时疏水性指数最低。由此可见， 高压改变了蛋白质的三、四级结 构。 8 结论结论 （1）酪蛋白经超高压处理后的胃蛋白酶水解，其酶解产物的水解度在 100MPa，15min 时达到最佳，为 11.1%，比未处理样水解度 8.27%提高了 34.22%， 高压处理改善了酶的活力。 （2）经 100MPa，15min 的高压处理，酶解产物的可溶性氮、肽基氮含量最 低，氨基氮含量最高，可溶性氮转化了部分氨基氮。 （3）酶解产物中作为蛋白质的三、四级结构的特征性指标巯基含量、疏水 性指标均在 100MPa，15min 时最低，高压通过改变
25、酶的三、四结构影响其水解 酪蛋白的能力。 9 10 参考文献参考文献 1 Sarah W, Gojka R. Global burden of diabetes mellitus in the year 2000J. Geneva:WHO,2000 2 张拥军,王兰州,姚惠源.南瓜中降血糖活性成分的提取及其功能性质的研J. 食品与发酵工业,2002,28(16):32-35 3 吉晓.燕麦能保健J.农产品市场周刊,2011,26:22-24 4 李慧,韩晓英,周雯.燕麦 -葡聚糖对小鼠免疫功能的影响J.实用预防医学, 2008,15(1):53-54 5 Buzrul, S. High hyd
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33、身受益。他不 仅在科学思维上给予我教导，而且在具体实验和论文书写中为我提供各种思路。 他的科研思维、科研方法、科研精神和治学认真、勤奋博学、求实创新的学者 风范，以及在生活上对人和蔼可亲的态度，都给我留下了深刻的印象，必将对 我以后的学 习、工作和生活起到很大的模范和促进作用。在此向马老师致以衷心的感谢和 深深的敬意！ 特别感谢潘润淑、王正荣老师在试验期间提供的试验帮助，使我的试验能 够很顺利的进行。 衷心感谢赵永红、白腾辉师兄，在实验期间和论文写作期间给予的大量支 持和帮助，才使我得以顺利完成实验和论文的写作。 感谢郝振宇、黄美佳、王敏、徐红娟等同窗在实验过程中给予的大量支持 和帮助。 最后，再次向所有关心和帮助过我的老师和同学们表示衷心的感谢！ 13