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1、厦门大学医学院本科毕业论文,CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性研究,答 辩 人：罗 静 指导教师：童卫杭 主管药师,主要内容,第一部分 研究背景,丙戊酸钠（Sodium Valproate, VPA） 一线抗癫痫药，目前仍无法取代 可用于多种类型的癫痫发作,图1.丙戊酸分子结构 Fig.1 molecular structure of valproic acid,研究CYP2C19基因多态性与丙戊酸血药浓度相关性具有临床研究价值,CYP2C19最主要的两个突变位点 CYP2C19*2:第5外显子681位 GA CYP2C19*3:第4外显子636位 GA 基因型鉴定：聚合酶链反应-
2、限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP） PCR：模拟体内DNA复制条件，体外酶促合成特异DNA片段的循环反应，以扩增目的DNA。 RFLP：某种限制性内切酶特异性识别位点，对DNA切割； 基因突变时特异性酶切位点消失，不被限制性内切酶切断； 利用电泳检测，观察条带分析基因型。 PCR-RFLP特点：操作简便，耗时耗费低 本实验中将采用准确度受公认的基因测序法验证该法的准确性,第二部分 实验方法,一、数据收集 2008年9月至2009年4月 第二炮兵总医院神经内科、神经外科门诊及住院部 服用丙戊酸钠的癫痫患者49例 筛选资料齐全的30例 记录性别、年龄、体重、治疗药物、治疗剂量、治疗药物血
3、药浓度、合并用药等情况。 二、血药浓度检测荧光偏振免疫法（FIP） 美国Abbott公司TDxFLx荧光偏振免疫测定仪及配套试剂盒 服用丙戊酸至少5个半衰期（2-2.5天）后，血药浓度达稳态时，于下次服药前，采抗凝静脉血4ml。 离心，取上清液（血浆）100l，进样测定。,三、基因型鉴定 1、提取DNA: 北京QIAGEN公司血液基因组提取试剂盒 提取所收集血样DNA 北京六一仪器厂DYY-II2型电泳仪和电泳槽 DNA样品电泳检测 紫外灯下判读结果，照相存档 2、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP） 2.1 PCR反应 德国Eppendof公司PCR扩增仪 设计并合成CYP
4、2C19引物： CYP2C19*2:前引物F 5-AGCAGGTATAAGTCTAGGAAA-3 后引物R 5-ACAAATACGCAAGCAGTC-3 CYP2C19*3:前引物F 5-ACTTTCATCCTGGGCTGTGC-3 后引物R 5ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3,建立反应体系： 蒸馏水9 l 前引物0.5 l，后引物0.5 l HotStar Taq Master Mix 12.5 l（包含4种dNTP，Mg2+，Taq DNA聚合酶，以及TrisCl-KCl缓冲液） DNA 模板2.5 l PCR反应条件： CYP2C19*2：94预变性15min94变性40s5
5、1退火30s72延伸30s 循环35次，最后72延伸10min。产物长度458bp CYP2C19*3：94预变性15min94变性30s56退火30s72延伸30s循环35次，最后72延伸10min。产物长度233bp。 PCR产物电泳检测 紫外灯下判读结果，目的条带清晰且无非特异扩增者进行下一步实验 照相存档,2.2 限制性长度多态性（RFLP） 美国New England Biolabs公司内切酶SmaI 、 BamHI 酶切反应： CYP2C19*2：用限制型内切酶SmaI30消化3h。SmaI酶切条件：PCR反应产物10ul；水16ul；10Buffer 2ul；SmaI 2ul。
6、CYP2C19*3：用限制型内切酶BamHI37消化3h。BamHI酶切条件：PCR反应产物10ul；水18ul；10Buffer BamHI 2ul；BamHI 1ul。 酶切产物电泳检测 紫外灯下判读结果，通过条带数目及位置，判断基因型 照相存档 3、基因测序 取前引物6l，与PCR产物同时送于测序公司分析基因序列 四、数据分析 Spss 12.0 standard version(Spss Inc.) 用双侧t检验和2检验。P0.05为差异有统计学意义,第三部分 实验结果,一、病人一般情况和治疗情况 男20例，女10例，男女比例2:1 平均年龄33.624.60岁，平均体重56.1518
7、.50kg 丙戊酸钠体重剂量范围2.3-27.7mg/kgd,平均值为11.74mg6.10/kgd 血药浓度范围7.97-89.96g/ml,平均值为44.5927.60g/ml 二、血药浓度监测情况 测定血药浓度样品150例次 血药浓度有效范围：40-100g/ml 低于有效浓度低限共65例次 超过有效浓度高限共2例次,三、全血基因组DNA提取与PCR扩增产物 1、琼脂糖凝胶电泳显示，提取的基因组DNA条带结果,2、CYP2C19*2、CYP2C19*3 PCR扩增结果 CYP2C19*2 PCR产物长度458bp,CYP2C19*3 PCR产物长度233bp,目的条带清晰，无非特异性扩增
8、条带，说明PCR扩增较为理想，符合研究要求。,四、基因型判定 1、限制性片段长度多态性法 CYP2C19*2突变位点：681GA 当等位基因为681G时，SmaI酶将片断切开成为272bp和186bp两条片断 当等位基因为681A时，酶切位点消失，片段不被切开 据此分析酶切结果，判断基因型，见图5： GG基因型，也称野生型-272、186bp两条片断 GA基因型，也称突变杂合子-458、272、186bp三条片断 AA基因型，也称突变纯合子-458bp一条片断,CYP2C19*3突变位点：636GA 当等位基因为636G时，BamHI酶将片断切开成为137bp和96bp两条片断 当等位基因为6
9、36A时，酶切位点消失，片段不被切开 据此分析酶切结果，判断基因型，见图6： GG基因型，也称野生型-137、96bp两条片断 GA基因型，也称突变杂合子-233、137、96bp三条片断 AA基因型，也称突变纯合子-233bp一条片断,2、基因测序法,图7.基因测序图谱,从测序图谱分析： 在突变位点只有G峰的，为GG型 在突变位点只有A峰的，为AA型 在突变位点有G和A双峰的，为AG型,限制性片段长度多态性分析结果与基因测序结果一致 两种DNA鉴定方法相互验证，证明所建立的限制性片段长度多态性法准确、可靠,五、等位基因和基因型分布 1、基因频率与基因型 CYP2C19*2的基因频率与基因型统
10、计结果见下表,CYP2C19*3的基因频率与基因型统计结果见下表,2、双位点基因型 理论上应该有九种双位点基因型： CYP2C19*2 GG - CYP2C19*3 GG（纯合野生，无突变） CYP2C19*2 GG - CYP2C19*3 GA（*2纯合野生，*3杂合子） CYP2C19*2 GA - CYP2C19*3 GG（*2杂合子，*3纯合野生） CYP2C19*2 AA - CYP2C19*3 GG（*2纯合突变，*3纯合野生） CYP2C19*2 GG - CYP2C19*3 AA（*2纯合野生，*3纯合突变） CYP2C19*2 GA - CYP2C19*3 GA（*2杂合子，
11、*3杂合子） CYP2C19*2 GA - CYP2C19*3 AA（*2杂合子，*3纯合突变） CYP2C19*2 AA - CYP2C19*3 GA（*2纯合突变，*3杂合子） CYP2C19*2 AA - CYP2C19*3 AA（*2纯合突变，*3纯合突变）,由于样本量的限制，在此次研究中，只发现了*2GG-*3GG,*2GA-*3GG,*2AA-*3GG,*2GG-*3GA,*2GA-*3GA五种双位点基因型。各基因型频率分布见下表,六、CYP2C19基因型与丙戊酸血药浓度的相关性 血药浓度/体重剂量血药浓度标准化，排除服药剂量和体重对血药浓度的影响 进行基因型与血药浓度/体重剂量相
12、关性分析，结果如下 1、各种基因型与血药浓度的关系 单独分析CYP2C19*2基因位点，血药浓度/体重剂量比值的大小顺序为：GGGAAA 单独分析CYP2C19*3基因位点，血药浓度/体重剂量比值的大小顺序为：GGGA 带有突变的基因型比值均高于野生基因型，但差异没有统计学意义，见表4,2、各种双位点基因型与血药浓度相关性 研究发现，5种双位点基因型中，血药浓度/体重剂量比值大小顺序为： *2GG-*3GG *2GG-*3AG *2AG-*3GG ，见表5（其中*2AG-*3AG和*2AA-*3GG都只有1例） *2AG-*3GG基因型血药浓度/体重剂量比值明显高于*2GG-*3GG，其他基因
13、型比值均高于*2GG-*3GG，但结果没有统计学差异,第四部分 分析讨论,一、关于实验技术的讨论,用于药物代谢酶基因多态性研究的基因分型方法,限制性片段长度多态性（RFLP）分析,基因测序法,单链构象多态性分析（SSCP）,变性高效液相色谱（DHPLC）分析,变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析,其中，基因测序法结果精准，但费用较高，不适于临床样品常规检测 DHPLC法目前已不单独使用，多为结合其他技术作辅助使用,二、关于实验结果的讨论 1、基因频率与基因型 本研究所得各种基因型与双位点基因型的频率，均与文献报道相似（CYP2C19基因多态性对癫痫患者丙戊酸血药浓度的影响，北大药学院，于洁，邵宏等
14、） 基因突变率较高，证实中国人群中研究CYP2C19基因多态性与血药浓度的相关性，有临床研究价值。 2、基因型与血药浓度的相关性 基于样本量不足，我们对数据进行分析没有统计学差异 但在研究中发现*2AG-*3GG基因型血药浓度/体重剂量比值明显高于*2GG-*3GG，因此可以认为CYP2C19基因多态性影响丙戊酸血药浓度 *2GG-*3AG的血药浓度/体重剂量比值较之*2AG-*3GG，与*2GG-*3GG较接近，是因为*3位点上的基因突变率较*2位点的低。 在临床使用中，携带*2AG-*3GG基因型的患者较之野生基因型者丙戊酸血药浓度会明显升高，若要达到某一目标血药浓度，携带*2AG-*3G
15、G基因型的患者较之野生基因型者丙戊酸剂量应减少,三、关于下一步实验的设想 1、针对目前实验的不足，下一步的工作中可在以下几个方面进行完善,样本量不足,继续收集血样，扩大样本量，进行更广泛深入的研究,相关基因仍有待研究,陆续开展CYP2A6、UGT等与丙戊酸血药浓度相关性研究,未考虑合并用药影响,丙戊酸钠合并用药常为卡马西平，苯巴比妥一类CYP450s诱导剂，影响丙戊酸血药浓度，应纳入研究,未研究不良反应发生率,监察患者不良反应与丙戊酸血药浓度，服药剂量，基因型的关系,2、关于实验的其他设想,在上述工作取得进展后，我认为还可以在如左所述几个方面开展工作，以取得丙戊酸个体化用药研究的新突破,致谢,本文是在临床药学室童卫杭老师的悉心指导下完成的，在此谨对导师的辛勤奉献和热情关怀致以最诚挚的感谢。 刘丽宏主任和马萍副主任也对本文进行了严格的督导，丁春雷、雷宁、李鹏飞、吴诚、杨润涛、张晓菲老师在实习期间给予了耐心的教导和无私的帮助，在此表示衷心的感谢。 感谢厦门大学领导和老师的教育与培养，为我们提供了良好的学习氛围和文化视野。 感谢实习队友张琼娥、林玉香和唐静的陪伴与帮助。 谢谢远在家乡的母亲，兄长及各位好友，谢谢他们无私的关爱和支持。,厦门大学医学院本科毕业论文,Thank You!,欢迎各位批评与指正,