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1、DNS法分析蛋白质末端氨基酸,一、实验目的 学习用DNS法分析蛋白质及肽的N-末端，掌握聚酰胺薄膜层析法的实际操作。,二、原理 蛋白质N-末端氨基酸的2-氨基与荧光试剂DNS-Cl(二甲氨基萘磺酰氯)反应后得到Dansyl-蛋白质(二甲氨基萘-5磺氨酰蛋白)，经酸水解，得到Dansyl-氨基酸和各种游离氨基酸。DNS-氨基酸在波长254nm或265nm的紫外光照射下发出强烈的黄绿色荧光，并易于进行色谱分离，用聚酰胺薄膜层析可测出含量仅为10-9-10-l0摩尔的DNS-氨基酸，比FDNB(2，4二硝基氟苯法)的灵敏度高100倍左右。 实验中所得的DNS-氨基酸比相应的FDNB法得到DNP-氨基
2、酸更稳定，且耐酸水解。,本实验的反应首先在碱性(pH9.5-10.5)条件下，使蛋白质或多肽的N-末端氨基酸与DNS-Cl结合，得到二甲基氨萘-5-磺酰蛋白(DNS-蛋白)。此DNS-蛋白在6moll,HCl中水解时，蛋白质中的肽键均发生断裂，得到游离的氨基酸，而N-末端的氨基酸形成DNS-氨基酸。对此DNS-氨基酸进行鉴定，即可确定蛋白质的N-末端氨基酸。 DNS-C1能与所有的氨基酸作用生成具有荧光的衍生物，这些衍生物都相当稳定，在5.7molL盐酸溶液中经105条件下水解22h，除DNS-色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸、DNS-丝氨酸(35)、DNS-甘氨酸(18)及DNS-丙氨酸(7
3、0)也被破坏，但其他DNS-氨基酸没有任何损失。,本实验采用的聚酰胺薄膜层析是20世纪70年代后发展起来的一种层析技术。聚酰胺薄膜是将锦纶涂布于涤纶上制成的。锦纶是由己二酸和己二胺聚合成的。其中含有大量的酰胺基团。由于酰胺的-CO基及-NH2可与被分离组分形成氢键，因此可以吸收酸类、酚类、硝基及胺基化合物等。由于被分离物质与其形成氢键的能力不同，因此对各种物质吸附的强度亦不同。因此选择适当的溶剂，使被分离物质在膜表面与溶剂间的分配系数产生较大的差异，经过吸附与解吸附的层层过程，使被分离物质彼此分开。 与纸层析相比，聚酰胺薄膜层析在分析氨基酸衍生物时具有灵敏度高、分辨率强、速度快、操作方便等优点
4、，在生化分析中起到了越来越重要的作用。,三、实验器材 紫外灯 烘箱 恒温箱 聚酰胺薄膜 层析缸 吹风机 毛细管。,四、材料与试剂 结晶胰岛素 02molLNaHC03 1molLNaOH 乙酸乙酯 DNS-C1丙酮溶液(25mgmL) 6molLHCl 展层溶剂： 甲酸：水=15：100(VV)(第一相) 苯：冰乙酸=9:l(VV)(第二相)。,五、操作方法 蛋白质样品的Dansyl化： 用0.2molLNaHC03将结晶胰岛素配成2mgmL的溶液，用1molLNaOH调节pH到9.0-9.5。取上述溶液4滴滴于小离心管中，加人4滴DNS-C1丙酮溶液，混匀，用胶布封口，置40烘箱中保温1h，
5、取出后真空抽干(或60蒸去丙酮)。固体混合物即为DNS-胰岛素。,DNS-胰岛素的水解和DNS-氨基酸的抽提：在上述离心管内，加入02mL6molLHCl溶液，使其溶解，转移到小安瓿管中，用火焰封口，置110烘箱水解18h左右。水解后开管，真空抽干或用吹风机吹干，加2滴02molLNa2C03溶液，并用1molLHCl调pH至2025，加入56滴乙酸乙酯，稍微晃动，安瓿管上层乙酸乙酯层内含DNS-末端氨基酸，再用乙酸乙酯抽提23次，加入01mL丙酮溶解，待用。,DNS-标准氨基酸的制备：由于已知胰岛素A、B链的N-末端分别为甘氨酸和苯丙氨酸，因此将标准甘氨酸和标准苯丙氨酸分别用0.2molLN
6、aHC03配成0.5mgmL浓度的溶液，用lmolLNaOH调到pH9.0-9.5。用滴管取标准甘氨酸液3-4滴装入安瓿管内，再取苯丙氨酸溶液3-4滴装入另一小管中，在每个小管中加入等体积的DNS-Cl丙酮液，摇匀，用胶布封口，置40温箱保温1h。取出，蒸去丙酮，滴人lmolL的HCl液调pH2.0-2.5，加入乙酸乙酯5-6滴，稍晃动，离心管上层乙酸乙酯层即含DNS-标准氨基酸，再用乙酸乙酯抽提23次，蒸去乙酸乙酯，加入0.1mL丙酮溶液，待用。,DNS-氨基酸的层析：将聚酰氨薄膜剪成7cmX7cm的方块，距边lcm处画上一直线作为基线，基线上画几个X点，作为点样起始点。 点样：将DNS-胰
7、岛素水解液与DNS-甘氨酸，DNS-苯丙氨酸一起点在基线X处，点样直径不超过2mm，每点完一次，用吹风机吹干。 展层：将点完样品的薄膜光面向外，聚酰氨面向内，用橡皮筋或照相底片圈(用lmolLNaOH溶液煮过)箍住，置于装有第一相层层溶剂的培养皿中，进行单向层层，直到溶剂前沿距顶1cm，取出薄膜吹干。将聚酰胺薄膜倒转90，在第二相溶剂进行第二向层层，直到溶剂前沿距顶端lcm处，取出聚酰氨薄膜，吹干。,结果分析：将层析后的薄膜置于254nm或265nm的紫外灯下观察，将绿色荧光点画在膜上，通过样品水解N-末端氨基酸与DNS-甘氨酸，DNS-苯丙氨酸的层析位置比较，证明胰岛素N-末端是哪一种氨基酸?,六、思考题 1聚酰胺薄膜层析具有哪些特点? 2胰岛素N-末端是哪一种氨基酸?,