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1、医学生物化学与分子生物学实验教程,第三篇 生物化学与分子生物学实验 第二十一章 综合性实验 实验3 血清蛋白的盐析及清/ 球比值测定 P179,实 验 二,血清蛋白的盐析及清/ 球比值测定,掌握盐析的原理和方法。 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理和方法。 了解血清蛋白质定量测定的临床意义。,【实验目的】 （Experimental Objectives）,(Experimental Principles) 蛋白质的胶体性质 蛋白质的呈色反应考马斯亮兰染色法,【实验原理 】,盐析,：是使蛋白质从溶液中沉淀的一种方法。,（1）蛋白质作为胶体在水中的稳定存在的因素,电荷(同种电荷相斥） 水化膜（隔离
2、）,Pr,+,+,+,+,+,+,中性盐破坏了这两个稳定性因素，使蛋白质沉淀。,【实验原理 】,中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。,沉淀蛋白质的方法还有哪些？,【实验原理 】,蛋白质的沉淀：蛋白质从溶液中析出。 沉淀的原因:破坏水化膜;改变蛋白质表面基团的解离。 沉淀的方法:盐析法;有机溶剂法;重金属盐沉淀法;生物碱试剂沉淀法；加热沉淀。,【实验原理 】,正常人的血清总蛋白中清蛋白占绝大部分约60%以上
3、，其余为球蛋白，两者比例为1.5-2.5：1。兔血清清球比0.6-1.5：1。 清蛋白在水中溶解性大于球蛋白，在血清中加入硫酸铵至半饱和时，球蛋白可被完全沉淀，而清蛋白保持溶解状态，依此可将清蛋白和球蛋白分离。,【实验原理 】,蛋白质的呈色反应 考马斯亮蓝显色法,考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue）与蛋白质中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合，使溶液呈蓝色。此时蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。常用于快速定量分析。,考马斯亮蓝G-250,【仪器试剂】 血清、饱和硫酸铵溶液、标准蛋白溶液、 考马斯亮蓝G-250 722S型分光光度计；,标准曲线的
4、绘制及标准曲线法,1 2 3 4 5 样品 标液 C1 C2 C3 C4 C5 CX A A1 A2 A3 A4 A5 AX,1.标准曲线制作 （1）蛋白标准液的倍比稀释：,【操 作 步 骤】（Operating Procedure）,（2）标准曲线的制作,将溶液充分混合，放置2min后开始测吸光度A595nm.,【操 作 步 骤】 （Operating Procedure） （一） 血清蛋白的盐析 取1.5 ml EP管1支+0.5 ml血清滴加饱和硫酸铵0.5 ml（血清已被稀释了2倍），边加边混匀室温静置5分钟后，10000rpm，离心2分钟转移上清至另一支EP管内备用，此为盐析上清。,
5、(二).血清中蛋白质浓度的测定 （1）血清样品的稀释：取2支1.5 ml EP管， 标记1号、2号，按下表稀释.留2号管备用。,总蛋白,（2）盐析上清（清蛋白）的稀释：取2支1.5 ml EP管 标记3号、4号，按下表稀释,清蛋白,（3）血清中蛋白质浓度的测定：取2支大试管， 标记5号、6号，按下表加入试剂。,取样后充分混合，放置2min后,记录A595nm，并通过标准曲线查得待测样品中蛋白质浓度。,清蛋白,总蛋白,（三）绘制标准曲线，计算血清蛋白浓度、清蛋白 浓度及清/球比值。 血清蛋白（总蛋白）浓度 = 图示值200（稀释倍数）= （mg/ml） 盐析上清（清蛋白）浓度 = 图示值200（
6、稀释倍数）= （mg/ml） 计算清/球比值: 清蛋白的浓度/（总蛋白的浓度-清蛋白的浓度） =,思考题(Questions) 蛋白质分离纯化的方法？ 凯氏定氮法 双缩脲法(Biuret) 紫外吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford） Folin酚试剂法,血清蛋白质测定的临床意义,肝脏的基本功能,肝脏是人体内的最大腺体 代谢功能90蛋白、糖、脂、胆汁酸、胆红素、激素灭活及部分金属 生物转化功能氧化、还原、水解、结合 分泌和排泄功能,1、血液生化检验（肝功检查） 肝脏的合成功能：总蛋白（TP）、清蛋白（ALB）、球蛋白（GLO） 肝细胞受损的情况：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST） 肝细
7、胞的代谢功能：直接胆红素（DBIL）、总胆红素（TBIL） 2、病毒标记检测（乙肝五项）。,肝脏病的实验室检查主要包括两个方面：,血清总蛋白和清蛋白、球蛋白比值测定,一、蛋白质代谢功能检查,正常成人血清： 总蛋白 60-80gL 清蛋白 40-55gL 球蛋白 20-30gL AG 1.5-2.5 : 1,参考值范围,蛋白质代谢功能检查,血清总蛋白 （Serum total protein；TP） 静脉采血2ml，不抗凝，分离血清进行测定。 血清总蛋白包括白蛋白及球蛋白。 【正常参考值】 6080 g/L,【异常结果分析】 总蛋白增高： 急性失水所致血液浓缩，如严重呕吐，腹泻，大量出汗。 某些
8、球蛋白增多疾病，如多发性骨髓瘤，巨球蛋白血症等 总蛋白降低： 病因基本同清蛋白降低,清蛋白（Albumin；ALB） 静脉采血2ml,不抗凝，分离血清进行测定。 清蛋白几乎都由肝脏合成，它是血浆中的主要蛋白成分，具有结合，转运其他分子、维持血浆胶体渗透压等重要作用。 【正常参考值】 40 55 g/L,【异常结果分析】 清蛋白降低： 肝细胞病变：慢性肝炎，肝硬化，肝坏死，肝癌，肝功能严 重受损等。 蛋白丢失过多：肾病综合征，大面积烧伤，浆膜渗出性损害等 蛋白摄入不足：如营养不良，慢性腹泻，吸收不良综合征等。 慢性消耗性疾病：如恶性肿瘤，结核病，甲状腺功能亢进， 长期慢性发热等。,清蛋白球蛋白比值（AG） 静脉采血2ml，不抗凝，分离血清进行测定 【正常参考值】 1.52.5 【异常结果分析】 AG比值1提示有慢性肝实质性损害。 动态观察AG比值可提示病情的发展和估计预 后，病情恶化时清蛋白逐渐减少，AG比值下 降，AG比值持续倒置表示预后较差。,可以是清蛋白降低或球蛋白增高。 见于严重肝功能损伤及M蛋白血症，如慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症等。,临床意义,AG倒置,下次实验：,第三篇 生物化学与分子生物学实验 第二十章 基础性实验 实验3 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的 竞争性抑制作用 P123,