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1、大鼠肢体缺血再灌注早期血栓前状态的研究作者：杨敏，马平，徐文会，张宏江 作者单位：(山西医科大学第二附属医院麻醉科，山西 太原 030001) 【摘要】 目的 探讨大鼠急性下肢缺血再灌注早期血栓的形成情况。方法 将大鼠随机分为假手术组、下肢缺血再灌注组两组。夹闭大鼠股动脉并用张力带绑扎下肢，建立急性下肢缺血再灌注大鼠模型。观察急性下肢缺血再灌注大鼠血小板膜糖蛋白GPb/a和血管内皮细胞血栓调节蛋白(thrombomoclulin，TM)的表达。结果 缺血再灌注组大鼠血小板膜糖蛋白GPb/a表达高于假手术组(P0.05)；缺血再灌注组大鼠血管内皮TM表达低于假手术组(P0.05)。结论 急性下肢
2、缺血再灌注可能导致大鼠血栓前状态的形成。 【关键词】 肢体缺血再灌注；血栓前状态；血小板膜糖蛋白；血栓调节蛋白 Prethrombotic State in Rats after Ischemiareperfusion of Limb and its Intervention Study YANG Min，MA Ping，XU Wenhui，et al (Department of Anesthesia，the 2nd Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China) Abstract：Objective To invest
3、igate the emerge condition of thromb in rats after ischemiareperfusion of limb.Methods The rats were randomly divided into 2 groups：sham operation group(N group)；the hind limb ischemia reperfusion group (IR group).An animal model of acute hind limb ischemiareperfusion was developed by clamping femor
4、al artery and banding hind limb of rats.Changes in the expression of GPb/a of platelet membrane and TM of vascular endothelial cell in rats after ischemiareperfusion of limb were observed.Results The expression of GPb/a of platelet membrane in the IR group was significantly higher than that of the N
5、 group (P0.05).The expression of TM of vascular endothelial cell in the IR group was significantly lower than that of the N group (P0.05).Conclusion Acute hind limb ischemiareperfusion may induce the formation of prethrombotic state in rats. Key words：limb ischemiareperfusion；prethrombotic state；pla
6、telet membrane lycoprotein；thrombomodulin 缺血再灌注损伤是临床肢体血运重建后出现意外致残、致死的主要原因之一，是当今外科临床医生所常面对的具有挑战性的问题之一。创伤、断肢再植、术中使用止血带时间过长、腹主动脉瘤手术中钳夹血管及大血管栓塞再通等都可引起肢体缺血再灌注损伤。肢体缺血再灌注损伤是处于顿抑、休眠的肢体在血运重建之后的损伤导致的机体生理、生化改变和各器官的病理改变，这种损伤几乎影响到整个机体，进一步导致如心、肺、肾等远隔器官的损伤13，甚至发生多器官功能障碍4。尽管近来手术技术得以改善且围手术期管理水平有所提高，但死亡率和截肢率仍居高不下。如何认
7、识再灌注损伤的预防和治疗，降低致残率和死亡率，将是我们长期所要研究的课题。 缺血再灌注损伤的机制是多因素和错综复杂的，其中微血栓的形成可能起到重要作用。研究证实再灌注时血管内皮细胞和白细胞激活，内皮细胞释放多种黏附分子，激活的内皮细胞与白细胞相互作用，对微血管和细胞损伤产生影响。150多年前，Virchow就指出血管壁的损伤、血液流动的变化、血液性质的改变是形成血栓的三要素，而血栓前状态是很多因素引起的止血、凝血和抗凝系统失调的一种病理过程，具有易导致血栓形成的多种血液学变化，是血栓形成的前期阶段。本试验通过黏附分子血小板膜糖蛋白GPb/a和血管内皮细胞血栓调节蛋白(thrombomoclul
8、in，TM)的测定，从血管内皮损伤、血小板活化、抗凝作用减弱三个方面对肢体缺血再灌注后血栓前状态进行研究。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠，体重(20030)g，购于山西医科大学实验动物中心。 1.1.2 主要试剂及仪器 山羊抗大鼠GPb/a抗体，SANTA CRUZ公司；抗大鼠TM抗体，LAB VISION公司；FITC标记兔抗山羊IgG，北京中山金桥公司；SABC免疫组化试剂盒，北京中山金桥公司；Olympus BX51光学显微镜，日本；LeicaRM2015切片机，德国莱卡公司；IDA2000数码显微图象分析系统，中科院北京空海科技公司；Ca
9、libur流式细胞仪，美国BD公司。 1.2 实验方法 1.2.1 实验分组 分为假手术组、缺血再灌注组两组，采用随机化原则，每组8只。 1.2.2 动物模型制作 术前常规禁食12 h，自由饮水。以20乌拉坦(1 000 mg/kg)行腹腔内注射麻醉。将大鼠仰卧固定于操作台上，在后肢双侧股三角处剪毛，于腹股沟处沿血管走行纵行切开皮肤、皮下组织，钝性分离缝匠肌后部，游离股动脉、股静脉和股神经。在股动、静脉近端分别用动、静脉夹夹闭，并用张力带于股鞘下绑扎肢体阻断侧支循环。右颈部开口分离颈内静脉，置管建立静脉输液系统，接微电脑静脉微量输液泵。2 h后撤除血管夹，恢复动、静脉血流，3 h后进行标本采集
10、。 1.2.3 实验动物的处理 假手术组与缺血再灌组相同的麻醉与手术操作，但未行血管夹闭及张力带绑扎；缺血再灌注组缺血2 h，再灌注3 h。 1.2.4 标本制备和检测方法 检测GPb/a需取血，从心脏采血0.5 mL(3.8枸橼酸钠19抗凝)，1 000 r/min离心5 min，取上清5 uL加入试管中；加入一抗5 uL，避光孵育20 min；加入荧光标记二抗5 uL，避光孵育20 min；加1多聚甲醛200 uL固定30 min；PBS洗涤4 min，用流式细胞仪检测，每管收集GPb/a阳性细胞20 000个，记录GPb/a的阳性率。 检测TM需取血管，取股动脉、股静脉，脱水、石蜡包埋，
11、用免疫组化方法定性检测血管内皮细胞上TM的表达。步骤如下：a)切片常规脱蜡至水，二甲苯(20 min)二甲苯(20 min)100酒精(10 min)100酒精(10 min)95酒精(10 min)85酒精(10 min)70酒精(10 min)。b)3H2O2室温孵育510 min，以消除内源性过氧化物酶的作用。蒸馏水冲洗2 min，冲洗3次。c)热修复抗原：将切片浸入0.001M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔8 min后，重复1次，冷却2 h，冷却后PBS液(pH 7.4)洗涤2 min，冲洗2次。d)滴加5BSA封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。
12、e)滴加稀释150的一抗(抗大鼠IgG)，4过夜。PBS液冲洗2 min，冲洗3次。f)滴加生物素标记的羊抗小鼠IgG，室温20 min，PBS液冲洗2 min，冲洗3次。g)滴加试剂SABC室温20 min。PBS液冲洗5 min，冲洗4次。h)DAB显色，自来水冲洗。i)苏木素轻度复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。再用BX51型Olympus显微镜及IDA2000数码显微图像分析系统进行图像分析，每组观察30个高倍视野(400)，随机取8个视野，以平均光度为指标进行半定量分析。 1.3 统计学分析 用SPSS 11.5统计软件，实验数据以(s)表示，组间均数比较采用t检验。检验
13、水准取0.05，P0.05差异有显著性。 2 结 果 2.1 缺血再灌注组大鼠血小板膜糖蛋白GPb/a表达为(53.843.05)，高于假手术组(42.316.29)，二者比较具有统计学意义。 2.2 缺血再灌注组大鼠血管内皮TM表达低于假手术组(P0.05)(见表1)表1 急性肢体缺血再灌注大鼠血管内皮细胞TM的表达注：假手术组与缺血再灌组比较P0.05 3 讨 论 早在1944年，Jesse等5对止血带引发休克研究发现，止血带使用时间不超过3 h，引发止血带休克可能性极小，相反止血带使用时间超过3 h，则较易导致止血带休克，这种止血带休克不能通过静脉补充容量来预防。后来人们对动物骨骼肌缺血
14、代谢变化进行研究发现，随着缺血开始，骨骼肌的无氧代谢开始，细胞内的三磷酸腺苷、磷酸肌酸进行性耗竭，缺血3 h三磷酸腺苷就完全水解，而在缺血后1 h磷酸肌酸就完全水解。在28下，如果止血带时间不超过3 h，随着再灌注开始，细胞内三磷酸腺苷在再灌注2 h后恢复正常水平，而磷酸肌酸则在再灌注后1 h恢复到正常水平。如果缺血超过3 h，而缺血的肢体温度保持在2，也不会导致细胞内三磷酸腺苷、磷酸肌酸的耗竭，从而避免了细胞损伤。这可能与低温下细胞能量代谢降低有关6。Raymond等7用无创性P标记核磁共振分光镜观察细胞缺血再灌注时代谢改变得出，在肢体长时间的缺血中，如果每缺血1 h插入10 min再灌注，
15、则可维持细胞内三磷酸腺苷正常水平，快速恢复细胞代谢，保护细胞不受伤害；而Miller8等则认为插入5 min就可以恢复细胞正常代谢。临床手术中，使用止血带的最大时限为1.5 h，因此本实验选择室温下缺血2 h再灌注3 h造模以更加接近于临床研究。 近年来研究表明，肢体缺血再灌注可致微血管和细胞损伤。a)微血管血液流变学改变：缺血再灌注早期可见中性粒细胞黏附在血管内皮细胞上，随后可有血小板沉积和红细胞缗线状聚集；再灌注期，激活的血管内皮细胞和中性粒细胞表面可表达黏附分子，增强细胞间的亲和力，使细胞在微血管内流速减慢，造成“滚动”现象；随着再灌注时间延长，中性粒细胞、血管内皮细胞表面的黏附分子表达
16、进一步增加，中性细胞与内皮细胞发生黏附。黏附的中性粒细胞释放化学趋化物质，如白三烯、血栓素A2和血小板激活因子等，加重细胞间黏附和微血管堵塞。b)微血管口径的变化：损伤的内皮细胞肿胀、激活的血管内皮细胞和中性粒细胞释放缩血管物质、扩血管物质合成与释放减少等作用共同导致微血管口径变小。c)微血管通透性增高：自由基损伤和中性粒细胞黏附是微血管通透性增高的的主要原因。 150多年前，Virchow就指出血管壁的损伤、血液流动的变化、血液性质的改变是形成血栓的三要素，而血栓前状态是很多因素引起的止血、凝血和抗凝系统失调的一种病理过程，具有易导致血栓形成的多种血液学变化，是血栓形成的前期阶段9。表现在：
17、a)血管内皮细胞受损或受刺激；b)血小板和白细胞被激活或功能亢进；c)凝血蛋白(凝血因子)含量增高或被活化；d)抗凝蛋白(抗凝因子)含量减少或结构异常；e)纤溶因子含量减少或活性减弱；f)血液黏度增高和血流减慢10。 目前肢体缺血再灌注动物模型很难造成与临床情况完全相同，因此都有一定的局限性。主要的造模方法有11：a)止血带模型：是将橡皮止血带或气囊止血带扎于肢体近端阻断血流，造模操作简单。b)改良止血带模型：在麻醉下游离出肢体动、静脉，用血管夹阻断动、静脉，并用橡皮止血带环扎肢体以阻断侧支循环，此方法造模复杂，易出现伤口感染。c)将肢体某块肌肉分离出，保留或不保留血管束或血管神经束与活体相连
18、。因分离肌肉时已将组织切开且一块肌肉很难代表整个肢体，目前此模型较少应用。d)显露某条肌腱而不破坏表面微血管，观察缺血再灌注后的微循环变化。本研究采用改良止血带模型。临床手术中，使用止血带的最大时限为1.5 h，因此本实验选择缺血2 h再灌注3 h造模足以反映缺血及再灌注对机体造成的影响。 血小板参与血栓形成主要与血小板具有的功能有关，包括黏附、聚集、释放、促凝血功能。在血栓性疾病中，血小板活化与血栓形成存在密切关系。血小板膜糖蛋白GPb/a(CD41/CD61)归属于黏附分子中的整合素家族，70存在于血小板表面，30以隐蔽状态分布在开放管道系统和颗粒上。当血小板活化时，隐蔽状态的GPb/a复
19、合物全部表达在血小板膜表面。血小板通过与纤维蛋白原的联结而产生聚集，而血小板联结纤维蛋白原的结合点位于GPb/a分子上，是通过精氨酸天冬氨酸天冬酰胺序列与纤维连接蛋白及vWF等结合的。GPb/a与纤维蛋白原的结合过程是多种因素引起血小板聚集的共同通路，故GPb/a可以更直接地反映血小板的活化状态12。有研究表明血小板活化时可能形成一个黏附蛋白口袋，产生多个结合点，这种现象反映了GPb/a复合物在血小板活化时出现了许多离散的构型状态。本研究通过流式细胞仪检测GPb/a的分子数，可直接反映血小板活化状态。 参与血小板黏附反应的因素包括血小板、内皮下组织和血浆成分。血小板黏附受体主要归GPb，此外，
20、还有其他的黏附蛋白参与，比如GPb/a。在非流动条件下，GPb/a可以与Fn、vWF、Fg、TSP或胶原联结，但在流动条件下，GPb/a只与vWF结合，并使黏附的血小板在表面伸展，使血小板牢固地黏着在表面上，经得住高切变率时血流的冲刷而不脱落。 肢体缺血再灌注损伤与血小板的功能状态有重要关系。本研究观察到缺血再灌注组GPb/a表达量较假手术组表达量增加，表明肢体缺血再灌注后血小板有一定程度的活化，其机制可能是在肢体缺血再灌注后，微血管有一定程度的损伤，如内皮细胞受损、血液流变学改变(血液为非牛顿液体，其黏度随切变率的变化而发生了变化，在低切应力情况下，血液黏度升高血流阻力增大，导致流速减慢)。
21、内皮下胶原暴露，在低切变率情况下GPb通过vWF介导与胶原结合，胶原作为弱激活剂与其他激活剂(如ADP、肾上腺素等)使黏附的血小板激活，同时引起释放反应，进一步激活血小板。在此过程中TXA2被激活，TXA2作为强激活剂通过以PLC途径为主的不同途径激活血小板，活化的血小板膜表面表达更多的GPb/a复合物，两个相邻血小板的GPb/a可能会通过与纤维蛋白原的结合，产生“搭桥”作用，使血小板发生聚集。纤维蛋白原是目前已知最重要的GPb/a的配基，其上有两个GPb/a结合位点，可同时与两个活化血小板结合，从而导致血小板交联，介导血小板聚集。 这与刘育英等13应用免疫组化技术发现沙土鼠在脑缺血再灌注后1
22、.6 h血小板膜糖蛋白CD61表达水平显著升高一致。但与赵立明等14研究结果有差别，有待进一步研究。 TM是由575个氨基酸组成的单链糖蛋白，由中性粒细胞、单核细胞、血小板等合成释放，广泛分布于人体内的动脉、静脉、毛细血管和淋巴管的内皮细胞膜表面，血管内皮细胞受损，TM便从细胞中释放入血，内皮细胞表面TM减少，因此，近年来已把TM作为血管内皮损伤和破坏的一个新的标志物15，16。在功能上它是凝血酶激活蛋白C的辅因子，TM通过第5、6个上皮生长因子和硫酸软骨素链与凝血酶以11或12形成复合物，使凝血酶的空间构象发生改变，抑制凝血酶活性17，使其失去促纤维蛋白凝块形成及血小板聚集能力；在Ca离子参
23、与下，促进凝血酶活化蛋白C的效率提高20 000倍以上，其作为TM/PC/PS抗凝系统的效应分子，通过降解凝血因子Va和a，抑制内、外源性凝血反应，产生抗凝作用；TM还可促进抗凝血酶灭活凝血酶。TM由内皮细胞释放入血后，游离的凝血酶增多，TM的抗凝作用减弱，造成了促凝血作用，有利于血栓的形成。 本研究观察到缺血再灌注组TM表达量较假手术组表达量下降，TM作为血管内皮损伤和破坏的一个标志物，其在内皮细胞表达量的下降可能表明肢体缺血再灌注后血管内皮细胞受损伤，TM从细胞中释放入血；其次，TM通过与凝血酶形成复合物，使凝血酶的空间构象发生改变，抑制凝血酶活性，肢体缺血再灌注后，血管内皮细胞上TM的量
24、减少，凝血酶活性增强，促进凝血；再次，凝血酶与血管内皮细胞的TM形成的复合物激活凝血活化蛋白C的抗凝作用也因此减弱。且凝血酶又可引起白细胞和内皮细胞表达促炎介质(如TNFa、IL6、IL8等)和黏附分子(如CD11b、CD18、VCAM1等)介导炎症反应的发生发展，使损伤进一步加重。晋升网简介晋升网（http:/）致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄选海量优秀医学论文检索，独立研发医学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊类、标题、关键词检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、
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