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1、血红蛋白醋酸纤维薄膜碱性电泳,实验四,电泳： 指带电胶体粒子或分子在电场的作用下，作定向移动。 由于各种物质分子的等电点不同在同一P环境中所带的电荷各不相同,再由于分子量、分子结构、形状大小各有差异，因此在同一电场中泳动速度也就不一样。一般来说，所带的电荷多而分子量小、形状越接近球形者，泳动速度快，反之则慢。,电泳技术的分类：主要归纳为；,1）显微电泳即在显微镜下观察胶体粒子或细胞的移动度，也称细胞电泳。 2）自由电泳即悬浮在介质中的细胞和生物大分子，在电场作用下自由定向移动。,3）区域电泳（区带电泳）：即在不同电力条件、支持物上进行直接分离，鉴定生物物质，促使获得各自电荷差异的生物粒子或分子
2、形成各自区域以帯形停留在载体上。如：滤纸、淀粉、琼脂、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶等，此类 电泳技术分离技巧简便，运用十分广泛。 4）免疫电泳：即抗原与抗体在比例合适的琼脂糖载体中相结合的一种电免疫技术，亲和电泳即属此类。 。,根据缓冲液的性质不同可分为：,1.连续系统：电泳缓冲液的离子成分、PH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。 2.不连续系统：电泳缓冲液离子成分、pH、电位梯度与制胶（或浸膜）缓冲液不尽相同，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。,血红蛋白（Hb) 的组成及分类： 血红蛋白（Hb)：由亚铁血红素、珠蛋白 组成 。每个珠蛋白
3、分子由4条多肽链构成 ，根据其一级结构的不同可分为、四种类型。,正常成人Hb种类： 组成 百分含量 pI HbA 22 9598% 6.95 HbA2 22 23% 7.38 HbF 22 6.95,实验原理(Experimental Principles),在pH8.6的环境中，Hb是一种带负电荷的蛋白质（Hb的pI 8.6），在电场中向正极泳动。电泳时，由于各种Hb等电点不同，所带电荷量不同；分子量大小、形状不同，导致各自的泳动速度不同，因而被分离。这种分离可初步鉴定不同的Hb。,醋酸纤维素薄膜是由纤维素的羧基进行乙酰化后而制成的，浸湿后有巨大的张力和柔韧性，几乎对所有生物活性物质均能通过
4、电泳得到分离。 醋酸纤维素薄膜电泳因设备简单、操作方便、电泳时间短、分辨率高、区带分离清晰、无拖尾、易定量等，已成为临床、实验室首选的方法。,。,实验材料、主要仪器和试剂（Equipments , Materials and Agents）,1、试剂 0.9%的NaCl溶液；蒸馏水； 四氯化碳；碘酊；75%酒精；TEB缓冲液（pH8.6）；丽春红染液；漂洗液。 2、实验器材 醋酸纤维薄膜；滤纸；电泳仪；一次性穿刺针；消毒棉签。,操作步骤（Operating Procedure）,1.取血： 用2%碘酊棉球消毒受试者手指，再用75%酒精棉球脱碘，采血针穿刺，取血约0.05ml放入事先已加入0.9
5、%NaCl 1ml 的1.5ml离心管中。如出血不畅，可对手指稍加挤压。,2.制备Hb液： 1）洗涤红细胞：将上述离心管，颠倒混匀5-6次，4000rpm，离心3分钟。弃上清，再加1ml 0.9%NaCl悬浮红细胞，相同条件重复离心一次。 2）溶血：向红细胞沉淀中加入蒸馏水1 2滴，摇匀，再加入四氯化碳1滴，振荡混匀，相同条件再离心一次，取上清即得Hb液。,3.电泳 1）膜条准备： 2）点样：取出平衡好的膜条，用滤纸吸去多余的液体，然后平铺,（毛面朝上），用小玻片沾取适量Hb液，按印于点样线上，点样处离膜条边缘1.5cm左右。,3）电泳：在电泳槽内加入缓冲液，膜条点样面向下，上样一端靠近负极，
6、盖严电泳室。通电预电泳5-10min。调节电压为100V，电泳3040分钟。 4）染色：电泳完毕后关闭电源。将膜条取下，放在丽春红染色液中染色10分钟。 5） 漂洗：取出染色膜条，放入漂洗液中漂洗至凝胶背景无色为止。,结果与分析：（Results and Analysis ）,观察膜条上Hb条带的位置及颜色的深浅。绘图纪录之。,临床意义,异常血红蛋白： 指珠蛋白链中一个或数个氨 基酸被置换、缺失或增加，造成血红蛋白结构及功能异常，导致一系列病理和生理改变。是常见的遗传病之一. 人类异常血红蛋白高达两千多种类型，约300人中即有一人是异常血红蛋白携带者。因此，在临床上快速、早期诊断尤为重要。,血
7、红蛋白病分类,1.异常Hb病： 基因突变导致珠蛋白结构改变.例如：镰状红细胞贫血. 形成原因： 链第6位谷氨酸被缬氨酸取代，形成HbS（镰状Hb)取代了正常的Hb。在缺氧情况下，HbS聚合形成长棒状聚合物，使红细胞镰变,变形能力低，导致溶血、贫血，引起血粘度增高，血管梗阻性继发症状。,发病的分子基础是： 链基因的一个碱基对GAG变为GTG，致使血红蛋白的链N端第6位的谷氨酸被缬氨酸取代形成HbS。 2.地中海贫血： 基因突变导致珠蛋白肽链合成缺乏或合成量异常，如、地贫。,地中海贫血是由于，珠蛋白基因缺失、突变导致某种珠蛋白链合成障碍，造成链和链合成数量不平衡，引起的溶血性贫血。最初发现在地中海地区居住的人群发病率特别高，因而称为地中海贫血。 实际上世界各地都有发生，非洲和东南亚也比较常见。我国东南沿海地区高发。 血红蛋白病特点： b ；都表现为低色素性贫血。,