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1、Review Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll,综述：用Percoll介质分离血细胞和亚血细胞颗粒,常用的血细胞分类技术,1.组织化学或细胞化学染色(histochemical or cytochemic staining) 2.电子显微镜技术 (electron microscopy) 3. 流式细胞技术 (flow cytometry) 4. 单克隆抗体技术 (monoclonal antibody) 5. 免疫探针技术 (immune probe) 6.密度梯度离心 (density gradien
2、t centrifugation),密度梯度离心,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，中间或底层，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 离心力，离心时间和离子转子因介质和被分离物而已。 介质(media)的要求： 1.能产生密度梯度 2.密度高时，粘度不高 3.pH 中性或易调为中性 4.浓度大时渗透压不大 5.对细胞无毒,梯度离心常用介质,蔗糖 (Sucrose) 主要的不足表现为： 1. 高渗透压，密度越高渗透压越大，易使被分离物在所在的梯度带因渗 透压不适，而导致被分离物损伤。 2. 分子量过小(342)易使蔗糖渗入到细胞膜进入到细
3、胞质，从而破坏细胞。 3. 高粘性 盐(Salts) 常用的有CsCl, K-tartrate 和 NaBr, 主要不足同蔗糖1，2。 多聚蔗糖(Polysucrose) 即所谓的Ficoll, 分子量为400000左右，其主要特点为弥补了蔗糖的高渗透压， 但也是密度越高，渗透压越大。最大的弊端是太过粘稠，为蔗糖的好几倍，不 易脱糖。,碘化物(Iodinated compounds) 常用的有：Hypaque(泛影钠)，Urografin(泛影葡胺), Metrizoate(甲泛影钠)等。 混合介质(Mixed media) 常用的有：Ficoll-Paque, Histopaque, His
4、toprep,Lymphoprep等。 硅胶(Colloidal silica) 即所谓的percoll，“Of all substances tested, none came closer to providing all the desired characteristics than colloidal silica.”,Percoll理化特性,平均分子量6106, 渗透压20 mOsm，密度1.13g/ml. pH中性，生理盐水配制的percoll应用液等渗. 平均直径10-30nm. 硅胶经处理后，对细胞无毒性. （注：硅溶胶对细胞有毒性） 主要是在SiO2 coated一层聚乙烯
5、吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP),A: 0.15M NaCl, 35nm,B: 0.25M Sucrose, 30nm,Percoll 的使用,市售原液 1. 100%percoll原液 使用时percoll原液:10生理盐水=9:1配制成percoll应用液，再用生理 盐水将percoll应用液调制成各个梯度。 2. 已经用10生理盐水配制好的percoll应用液 使用时只需用生理盐水将percoll应用液调制成各个梯度即可。 梯度设置 1. Step gradients(不连续梯度),2. Continuous gradient(连续梯度) (1)高速离心 (2
6、)梯度混合器,样品的放置 1. 与percoll液混匀 2. 置于梯度顶层 3. 置于梯度底层 需用较大的离心力 样品的收集,Percoll在贝类血细胞分选上的应用,Separation of European flat oyster, Ostrea edulis, haemocytes by density gradient centrifugation and SDS-PAGE characterisation of separated haemocyte sub-populations Qing Gang Xue, Renault Tristan Fish & Shellfish Immunology (2000) 10, 155165,血细胞样品处理 上Percoll梯度：10%，30%，50%和70% 结果：10/30%界面处形成一带(P1)，50/70%界面处也形成一带(G)。 上Ficoll梯度：5%，10%，15%和20% 结果：5/10%界面处形成一带(F1)，10/15%界面处也形成一带(F2)。 血细胞染色 SDS-Page,P1,G,F1 Large hyalinocyte,F2 Small hyalinocyte,欢迎大家批评和指正！,