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1、二、 动物细胞融合与单克隆抗体,通过长期的实验，科学家们采用植物体细胞杂交技术获得了“白菜甘蓝”植株。,动物细胞也能融合吗？,（一）.动物细胞融合,1、概念：,请同学们阅读课本P52动物细胞融合,杂交细胞：,融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。,也称细胞杂交，是指两个或多个细胞结合形成一个细胞的过程。,2、动物融合的过程,动物细胞融合过程示意图,不同DNA的两个细胞,灭活的病毒,有丝分裂,两个完整的杂交细胞,思考题,1.植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？,酶解法，如纤维素酶或果胶酶,2.动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？,无需，因为动物细胞无细胞壁,3.植物
2、体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？,离心、电激等物理方法；PEG等化学方法,4.动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？,能 还可以利用灭活的病毒进行诱导,5.植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形 成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？,不能,不同DNA的两个细胞,2、动物融合的过程,诱导融合,方法：聚乙二醇、灭活病毒、电激等,杂交细胞,(1)、动物细胞融合基本原理：,细胞膜的流动性,（3）、应用：主要用于制备单克隆抗体,(2)、意义： 克服远缘杂交不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。,主要用于制备,单克隆
3、抗体,获得杂种植株,主要用途,物理、化学方法,（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振动、电刺激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱,导细胞融合,去除细胞壁后诱,导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、,植物细胞全能性,细胞融合的原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,3、比较,长期以来，人们为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以 上的特异性抗体，但每一个B淋
4、巴细胞只,泌一种化学性质单一、特异性强的抗体.,1.抗体是由何种细胞产生的？ 浆细胞 2.一个淋巴细胞(浆细胞)能分泌多种抗体吗？ 每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。 3.一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一种吗？ 动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上。 4. 简述获得抗体的传统途径？ 抗原 动物体 抗体 抗原不纯 抗体不纯,（二）、单克隆抗体,刺激,浆细胞,阅读课本第5354页内内容，回答相关问题是。,6.如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？ 体外培养单个淋巴细胞，提取分泌的抗体,7.体外培养淋巴细胞能无限增殖吗?怎样解决这个问题？,5.这种方
5、法获得的抗体有什么缺陷？ 产量低，纯度低，特异性差,设计方案： 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 小鼠骨髓瘤细胞能够在体外大量增殖,杂种细胞,（二）、单克隆抗体,1、原始获得抗体的方法：向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后，从动物血清中分离所需抗体。（缺点：产量低、纯度低、特异性差）,2、单克隆抗体制备过程：,单克隆抗体制备,免疫小鼠,培养骨髓瘤细胞,融合,骨髓瘤细胞,B淋巴细胞,注射特定抗原蛋白,选择培养基上培养,专一抗体检验阳性,专一抗体检验阳性,注射到小鼠体内,体外培养,单克隆抗体,克隆杂交细胞,分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞,单克隆抗体制备过程示意图,多种杂
6、交细胞,注射抗原,体外培养,体内培养,单克隆抗体制备过程,注射特定抗原,诱导融合,能分泌所需抗体的杂交瘤细胞,注射到小鼠腹腔,单克隆抗体,小鼠,相应的浆细胞,骨髓瘤细胞,选择性培养基 ，筛选,多种细胞,杂交瘤细胞,体外培养,从培养液中提取,从小鼠腹水中提取,说明：杂交瘤细胞特点：既能大量繁殖，又能产生专一抗体。,第一次筛选：选出杂交瘤细胞。,第二次筛选：选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,由单个B细胞克隆形成的细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体 。,3、单克隆抗体：,优点：特异性强、灵敏度高、并可大量制备 。,4.单克隆抗体的应用：,（1）作为诊断试剂：具有准确、高效、简易、快速的特点。,
7、“生物导弹”：借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位置杀死癌细胞。(在抗体上连接药物） 优点：疗效高、毒副作用小,（2）用于治疗疾病和运载药物。,知识结构,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法 灭活的病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势,教学反馈,1.动物细胞融合技术最重要的用途是 （ ） A.克服远源杂交不亲和 B.制备单克隆抗体 C.培育新物种 D.生产杂种细胞,B,2.单克隆抗体是由下列哪种细胞产生的 （ ） A.B淋巴细胞 B.T淋巴细胞 C.骨髓瘤细胞 D.杂交瘤细胞,D,3
8、.（多选）1975年米尔斯坦和柯勒成功地获得了单克隆抗体。下列细胞中与单克隆抗体的制备有关的是 （ ） A.效应B细胞 BT淋巴细胞 C.骨髓瘤细胞 D杂交瘤细胞,A B C D,4.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案,制备单克隆抗体,不能，没有将抗原注入小鼠体内，无法获得产生单一抗体的B淋巴细胞。,(1).该实验方案的目的是：_,(2).该方案能达到预期效果吗？为什么？,(3).A是从小鼠的脾脏中取得_ 该细胞能够产生_ 。,(4).图中B为_过程，常用_作为诱导剂，该细胞继承_的遗传特性，既能_,又能_。,(5).C过程指细胞培养，该过程包括_培养和_培养两个
9、阶段，其中_代以内的的细胞属于细胞株。,B淋巴细胞,抗体,细胞融合,灭活的病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,巩固习题,1. 单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞， 在这种培养基上不能存活增殖的细胞是 （ ） 淋巴细胞 小鼠骨髓瘤细胞 B淋巴细胞自身融合细胞 小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 杂交瘤细胞 A. B. C. D.,C,2.动物细胞融合和植物原生质融合决定于 ( ) A.细胞膜的流动性 B细胞膜的选择透过性 C.细胞质的流动性 D细胞质酶的活性,A,一.选择题,3.“生物导弹”是指 （ ） A.单克隆抗体 B.杂交瘤细
10、胞 C.产生特定抗体的B淋巴细胞 D.在单克隆抗体上连接抗癌药物,D,4.只能使动物细胞融合的常用诱导方法是 （ ） APEG B灭活的病毒 C电刺激 D离心,B,二.简答题,1.淋巴细胞是由动物体-中的-细胞分化发育而来的。 2.杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是-,骨髓,造血干,主动运输,三.思考与探究：55页 1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有什么不同？ 2.制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？,提示：植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术基本相同，不同的是植物体细胞融合前需去掉细胞壁，然后再融合；动物细胞融合是两个体细胞直接融合
11、。,提示：哺乳动物感染抗原后，其体内会形成相应的B淋巴细胞，B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗原。动物在免疫反应的过程中，每一种B淋巴细胞能分泌一种特异性抗体，要想获得大量的特异性抗体，必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋巴细胞具有产生单一抗体的能力，但不能在体外增殖；骨髓瘤细胞是一种癌细胞，它能在体外培养条件下无限增殖，但不能产生抗体。因此，把一种B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤细胞，它会兼有两个亲本细胞的特性在体外培养条件下能不断增殖，同时能产生出某种特异性的抗体。,2.为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细胞间的融合？,就目前常用的细胞融合方法来看，不管
12、是用物理的、化学的方法，还是生物的方法，其融合率都不可能是100%。仅用两个细胞融合，其效率太低，不一定能得到融合细胞。更重要的是，即使两个细胞已发生融合，但并不一定是研究者期望得到的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的应用就是单克隆抗体的制备。我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。我们知道，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上，但是每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体，如果仅取一个脾细胞（含B淋巴细胞）和一个瘤细胞杂交，我们不能确定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要的；若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合，就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。,3.如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养？,融合后的细胞经选择性培养基培养后，能存活的细胞就是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞，通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，使每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（常用酶联免疫吸附试验法），那些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行34次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。,