第4章二维核磁共振谱.ppt

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1、第四章 二维核磁共振谱 41二维核磁共振的概述 1什么是二维谱 二维核磁共振(2D NMR)方法是有Jeener 于1971年首 先提出的,是一维谱衍生出来的新实验方法.引入二维后,减少了谱 线的拥挤和重叠,提高了核之间相互关系的新信息.因而增加了结 构信息,有利于复杂谱图的解析.特别是应用于复杂的天然产物和 生物大分子的结构鉴定,2DNMR是目前适用于研究溶液中生物大 分子构象的唯一技术.一维谱的信号是一个频率的函数,记为 S(),共振峰分别在一条频率轴上.而二维谱是两个独立频率变量 的信号函数,记为S(1,2),共振峰分布在由两个频率轴组成的 平面上.2D-NMR的b最大特点是将化学位移,

2、偶合常数等参数字 二维平面上展开,于是在一般一维谱中重叠在一个频率轴上的信号 ,被分散到两个独立的频率轴构成的二维平面上.,同时检测出共振 核之间的相互作用. 2。二维谱实验 oA.原则上二维谱可以用概念上不同的三种实验获 得,(如图4.1) o(1).频率域实验(frequency- frequency) o (2).混合时域(frequency-time)实验 o(3). 时域(time-time)实验. o它是获得二维谱的主要方法,以两个独立的时间变 量进行一系列实验,得到S(t1,t2),经过两次傅立 叶变换得到二维谱S(1,2).通常所指的2D- NMR均是时间域二维实验 图4.1

3、2D-NMR 三种获得方式 B) 二维核磁共振时间分割 o二维谱实验中，为确定所需的两个独立的时间变量，要用特种技术 时间分割。即把整个时间按其物理意义分割成四个区间。（如图 所示） o（1）预备期：预备期在时间轴上通常是一个较长的时期，使核自 旋体系回复对平衡状态，在预备期末加一个或多个射频脉冲，以产 生所需要的单量子或多量子相干。 o（2）发展期：在t1开始时由一个脉冲或几个脉冲使体系激发，此 时间系控制磁化强度运动，并根据各种不同的化学环境的不同进动 频率对它们的横向磁化矢量作出标识。 o（3）混合期：在此期间通过相干或极化的传递，建立检测条件。 4）检测期：在此期间检测作为t2函数的各

4、种横向矢量的FID的 变化以及它的初始相及幅度受到t1函数的调制。 与t2轴对应的2（轴），通常是频率轴，与t1轴对应的1是 什么，取决于在发展是何种过程。 o相干(ccherence):是描述自旋体系状态的波函数 之间关系的一种物理量。，它通常没有简单的模 型，它是横向磁化及相位的量。（不仅包括 m=1, 而且包括m=0, m=2状态之间关系 )它可以通过射频脉冲的作用传递。 oC .实验过程：用固定时间增量t1依次递增t1进 行系列实验，反复叠加，因t2时间检测的信号 S(t2)的振幅或相位受到s(t1)的调制，则接收的 信号不仅与t2有关，还与t1有关，每改变一个t1 ，记录S(t2),

5、因此得到分别以时间变量t1,t2为行 列排列数据矩阵，即在检测期获得一组FID信号， 组成二维时间信号S(t1,t2)。因t1,t2是两个独立 时间变量，可以分别对它们进行傅立叶变换，一 次对t2,一次对t1,两次傅立叶变换的结果，可以得 到两个频率变量函数S(1,2)。如图 3二维谱的表达方式 （1）堆积图(stacked plot). o堆积图的优点是直观,具有立体感.缺点是难 以确定吸收峰的频率。大峰后面可能隐藏小 峰，而且耗时较长。 o(2)等高线（Contour plot） 等高线图类似于等高线地图，这种图的优 点是容易获得频率定量数据，作图快。缺点 是低强度的峰可能漏画。目前化学位

6、移相关 谱广泛采用等高线。 图4.3 堆积图 等高线 4二维谱峰的命名 o（1）交叉峰（cross peak）:出现在 12处，（即非对角线上）。从峰的 位置关系可以判断哪些峰之间有偶合关系， 从而得到哪些核之间有偶合关系，交叉峰是 二维谱中最有用的部分。 o（2）对角峰（Auto peak）:位于对角线 （12）上的峰，称为对角峰。对角 峰在F1和F2轴的投影。 5二维谱的分类 o二维谱可分为三类： o1）J 分辨谱（ J resolved spectroscopy ） oJ 分辨谱亦称J谱或者J谱。它把化学位移和自旋偶合的作 用分辨开来，包括异核和同核J谱。 o2）化学位移相关谱(chem

7、ical shift correlation spectroscopy) o化学位移相关谱也称谱，是二维谱的核心，通常所指的 二维谱就是化学位移相关谱。包括同核化学位移相关谱，异核 化学位移相关谱，NOESY和化学交换。 o3）多量子谱（multiple quantum spectroscopy）用 脉冲序列可以检测出多量子跃迁，得到多量子二维谱 。 42 化学位移相关谱（ Correlated Spectroscopy ,COSY） o二维化学位移相关谱包括 o同核化学位移相关谱（Homonuclear correlation） o1）通过化学键：COSY, TOCSY, 2D- INADE

8、QUATE。 o2）通过空间：NOESY, ROESY。 o异核化学位移相关谱（Heteronuclear correlation） o强调大的偶合常数：1H-13C COSY o强调小的偶合常数，压制大的偶合常数： COLOC(远程1H-13C COSY) 4.2.1同核化学位移相关谱 一。COSY(Correlated spectroscopy) o 所谓的COSY系指同一自旋体系里质子之 间的偶合相关。1H-1H-COSY可以1H-1H 之间通过成键作用的相关信息，类似于一维 谱同核去偶，可提供全部1H-1H之间的关 联。因此1H-1H-COSY是归属谱线，推导 结构及确定结构的有力工具

9、。 o1。COSY90。的基本脉冲序列包括两个基本脉 冲在此脉冲作用下，根据发展期t1的不同，自旋体 系的各个不同的跃迁之间产生磁化传递，通过同核 偶合建立同种核共振频率间连接图。此图的二个轴 都是1H的在12的对角线上可以找出一维 1H谱相对应谱峰信号。通过交叉峰分别作垂线及水 平线与对角线相交，即可以找到相应偶合的氢核。 因此从一张同核位移相关谱可找出所有偶合体系， 即等于一整套双照射实验的谱图 。 COSY of 2丁烯酸乙酯 2。COSY-45 。 o基本脉冲：90 。 t1-45 。 -ACQ. 在COSY-90的基础上，将第二脉冲改变成45 。许多的天然产物的直接连接跃迁谱峰在对

10、角线附近，导致谱线相互重叠，不易解析。 采用COSY-45 。由于大大限制了多重峰内 间接跃迁，重点反映多重峰间的直接跃迁， 减少了平行跃迁间的磁化转移强度，即消除 了对角线附近的交叉峰，使对角线附近清晰 。 3.相敏COSY谱(DQF-COSY) oCOSY 谱，由于谱线信号色散分量作用，相邻的 峰容易相互部分重叠，交叉峰的精细结构看不清 楚，不便读出偶合常数。 o相敏COSY (phase sensitive-COSY)谱的相 位很复杂，相位调节的质量直接影响偶合常数的 检测即信号灵敏度。在COSY谱中对角线与交叉 峰相位总是相差90。相敏COSY谱中，磁化转 移地结果产生一对交叉峰相位相

11、差180。以AX体 系为例。其交叉峰为纯吸收线形，对角线为色散 型。谱图黄色圆圈为正峰，红色为负峰。 o谱图正负峰以不同的颜色表示（下图蓝色圆圈为 正峰，红色为负峰）。也可以用实心表示正峰， 空心表示负峰。 o其交叉峰为纯吸收线形，对角线为色散型 o从相敏COSY可以直接读出J值。这里需要辨认主 动偶合和被动偶合。所谓的主动偶合就是相关交 叉峰直接的偶合。其余为被动偶合。主动偶合的 每一对峰总是一正一负。被动偶合的交叉峰是相 位相同（同为正或同为负） A M X o与COSY有关的实验自旋回波 COSY(SECSY),双量子相干谱（DQC- COSY）,同核接力相干谱（RCT）.有兴趣 的同学

12、，可以阅读有关的书籍。 二.天然丰度的双量子13C谱 INDEQUATE (13C-13C-COSY) 这是二维碳骨架直接测定法，是确定碳原子连 接顺序的实验，一种双量子相干技术。是一种 13C-13C化学位移相关谱。在质子去偶的13C谱 中，除了13C信号外，还有比它弱200倍的13C- 13C偶合卫星峰，13C-13C偶合含有丰富的分子 结构和构型的信息。由于碳是组成分子骨架， 它更能直接反映化学键的特征与取代情况。 o但是由于13C天然丰度仅仅为1.1%，出现13C- 13C偶合的几率为0。01，13C-13C偶合引起的 卫线通常离13C强峰只有20Hz左右，其强度又仅 仅是13C强峰的

13、1/200，这种弱峰往往出现在强 13C峰的腋部，加上旋转边带，质子去偶不完全， 微量杂质的影响等因素，使1JC-C测试非常困难 。利用双量子跃迁的相位特性可以压住强线，突 出卫线求出JC-C,并根据Jc-c确定其相邻的碳。 一个碳原子最多可以有四个碳与之相连，利用双 量子跃迁二维技术测量偶合碳的双量子跃迁的频 率。13C-13C同核偶合构成二核体系（AX,AB） 两个偶合的13C核能产生双量子跃迁，孤立的碳则 不能。 o它只有一个双量子跃迁，其频率正比于两个偶合 的13C核的化学位移之和的平均值。所以如果两个 碳具有相同的双量子跃迁频率，即可以判断，它 们是相邻。 o在INADEQUATE谱

14、图中F1与F2分别代表双量 子跃迁频率和13C的卫线，依次代表双量子和单量 子跃迁频率。谱图中一个轴是13C的化学位移，一 个为双量子跃迁频率，其频率正比于两个偶合的 13C核的化学位移之和的平均值。因此谱图中 F1=2F2的斜线两侧对称分布着两个相连的13C 原子信号，表示碳偶合对的单量子平均频率与双 量子频率间的关系，水平连线表明一对偶合碳具 有相同的双量子跃迁频率，可以判断它们是直接 相连的碳。依此类推可以找出化合物中所有13C原 子连接顺序。 18 11 16 15 17 13. 三。NOESY（Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) o核间磁化

15、传递是通过非相干作用传递，这种传递是靠交 叉驰豫和化学交换来进行。即样品间偶极偶极传递的 。它的基本脉冲是： o/2-t1-/2-tm-/2-ACQ NOESY的基本序列在COSY序列的基础上，加一个固定 延迟和第三脉冲，以检测NOE和化学交换的信息。混合 时间tm是NOESY实验的关键参数，tm的选择对检测化 学交换或NOESY效果有很大影响。选择合适的tm,可在 最后一个脉冲，产生最大的交换，或建立最大的NOE. NOESY的谱图特征类似于COSY谱，一维谱中出现出现 NOE的两个核在二维谱显示交叉峰。NOESY可以在一 张谱图上描绘出分子之间的空间关系。 COSY OF PBF NOES

16、Y of PBF COSY Codeine的NOESY 6,7 3 5 9 10 12 11 Codeine在高场放大的NOESY 13 13 18 18 16 17 17 11 14 8 - 7, 12 7 - 18, 18 3 - 5, 10 5 - 11, 16, 18 9 - 10, 17, 17 10 - 16 11 - 18, 16, 14, 18 18 - 13, 18 16 - 14, 17 13 - 14, 17, 17 13 - 17, 17 17 - 17 Table of NOEs 相敏NOESY 与COSY类似，NOESY也适用于相敏 形式。在这种相敏谱上，分辨率高，

17、容 易辨认信号峰，而且谱线比非相敏形式 的谱线狭窄，从而限制了假峰的产生， 有效增加了灵敏度。 phase-sensitive NOESY of strychnine. 四。TOCSY TOCSY脉冲序列： 是一种旋转坐标系实验（自旋锁定实验），自旋锁定是把 COSY序列中的第二脉冲以及NOESY序列中最后两个脉冲（包 括混合时间），用一个长射频脉冲取代，把自旋沿着旋转坐标 系的一个锁定，在这种情况下不存在化学位移差，通过发生标 量偶合的磁化转移，导致了全部相关。TOCSY也有称之为 HOHAHA.可以提供自旋系统中偶合关联信息。 oHOHAHA是通过交叉极化产生Hartmann-Hahn 能

18、量转移，从而观察较低旋磁比核一种方法。它 是通过增加混合时间，使一个质子的磁化矢量将 重新分布到同一偶合网络的所有质子，得到多次 的接力信息。由于增加混合时间，灵敏度降低， 为了解决这一问题，采用高分辨相敏方法，交 叉峰和对角峰都是吸收型，特别适用于具有独立 自旋体系的大分子，可进一步判断证实COSY中因 信号严重重叠而造成的不确定结果。选择适当的 参数可通过一次实验得到独立自旋体系所有质子 相关信息。2d-HOHAHA的特点是：通过改变t1 测定，将同核Hartmann-Hahn跃迁信号沿化学 位移二维展开，并用一个脉冲序列测得多重接力 COSY。在复杂偶合体系1H信号归属于解析中， 而且在

19、肽类，核苷，蛋白质等发挥巨大的作用。 质子 a, b, c and d 构成 自旋体系既一个偶合网络系统, CH3CH2构成另外一个网络系统，这是两个独立的自旋体系 ， COSY spectrum, CH2 a与 CH2 b.相关而在 TOCSY spectrum,它不仅显示与质子b相关，而且也与 it would also show correlations to 两个（CH2） c and d.相关。 TOCSY of codeine COSY TOCSY 3 9 10 12 11 18 16,13,14,1318 3,16 3,5 3,16 3,9 5 3-10 3,10 3,5 Tab

20、le of TOCSY peaks: ( indicates the more upfield of geminal CH2 protons) 8 7 3 5, 9, 10, 16 5 9, 10, b11, 16 9 10, 16, OH, H2O 10 16, OH, H2O 11 16, 18, 18 18 16, 18 16 18 13 13, 17, 17 13 17, 17 17 17 ROESY(CAMELSPIN) o若采用一个弱自旋锁场，则在旋转坐标体系 中产生交叉驰豫NOE,得到ROESY谱（ Rotating NOE),即旋转坐标系中的NOE增 强谱。又称之CAMELSP

21、IN谱。它类似于 NOESY，能提供空间距离相近的核的相关 信息。它的基本序列与TOCSY相似，但采 用低功率自旋锁场，可由连续波照射或一系 列小脉冲角脉冲组成混合脉冲。 o基本序列：/2-t1-(CW)X-ACQ oROESY 与NOESY区别： oNOESY在分子量大和小的分子体系中，灵敏度很 高。小分子的快速运动，产生NOE,大分子的或降 温产生负NOE.而中等分子（3001500）或特 殊形状分子，在NOESY中得不到交叉峰。 o而ROESY交叉峰与分子量的大小无关。 o由于ROESY是低的功率实验，可以检测到小的相 互作用。 4.3异核化学位移相关谱-Heteronuclear Co

22、rrelation of chemical shift o所谓异核化学位移相关谱是两个不同核的频 率通过标量偶合建立起来的相关谱.应用最 广泛的是1H-13C COSY. o1.1H-13C COSY. o常规的1H-13C COSY是指直接相连的C-H 之间的偶合相关（1JCH）。 基本脉冲： 该实验的关键是选择一个适合的混合期，以使13C核和氢核的信息充 分转移，即选择合适的12。 o 1H-13C-COSY谱图中F2为13C化学位移， F1为1H化学位移，没有对角峰，其交叉峰 表明C-H偶合的信息。解析时，可以从一已 知的氢核信号，根据相关关系，即可找到与 之相连的13C信号，反之亦然。

23、可以从谱图 中得到1JC-H的结构信息。 13C-1H COSY2-丁烯酸乙酯 A D C B o7.7 o8.15 o7.4 o7.5 111.6 120.6 122.6 127 2.COLOC(Correlation Spectroscopy via long range coupling) 和1H-13C-COSY序列基本一样，只是在COLOC谱中的1，2 对应于远程C-H偶合常数nJ(2JCH,3JCH),而不是1JCH.得到一键以上 的CH偶合相关信息，建立C-C之间的关联，可以跃过N,O等其它官 能团。成为推导结构归属信号，解决由于屏蔽效应难以解决的季碳归 属的有力工具。由于该方法

24、能够将季碳和相邻碳的质子相关，对于确 定C-C连接非常有效。 o常规的1H-13C-COSY没有季碳和其它质子 的相关峰。COLOC 谱图类似于C-H- COSY,两个坐标（F1,F2)是化学位移，交 叉峰也类似于C-H-COSY，只是出现了小 偶合的相关峰。COLOC最大的缺点是相关 峰中包含所有的1JCH信号。解析谱图时一定 要对照C-H-COSY。确定1JCH,分辨出 2JCH,3JCH. 7.7 8.15 7.4 7.5 127 122.6 120.6 111.6 A D C B 7 . 7 8 . 1 5 7 . 4 7 . 5 7.7 8.15 7.4 7.5 111.6 120.

25、6 122.6 127.0 7.7(d,1H,J=9.0,H-1),8.15(d,1H,j=8.8Hz,H-4) 7.5(dd,1H,J=9.0,0.8Hz,H-3),7.4(dd,1H,8.8,1.2Hz,H-2) 111.6(d,C-1),122.6(d,C-2),127.0(d,c-3),120.6(d,c-4) 156.2(s,c-5),124.2(s.c-6) 4。4多量子跃迁谱 o常见的核磁是选择m=1的单量子跃迁 。在偶极相互作用及其影响下，自旋体系的 能级不再由单一态波函数，而变成混合态， 可能出现m=0，2，3。的跃迁 ，称之为多量子跃迁。多量子跃迁指的是不 满足选择m =

26、1跃迁。其中m表示体 系的总磁量子数，它们按照m 2, 3。 o称为n量子跃迁，而不问具体含几个跃迁。 o产生的多量子跃迁不能直接观察到，要把它变回 可观察的单量子跃迁才能进行检测，得到 S(t1,t2)后经过傅立叶变换得到频率谱。常见的 多量子跃迁谱有HMQC,HMBC.与1H- 13CCOSY,COLOC谱相似。由于多量子相干转移 ，使其灵敏度大大提高。对于测定时间相等的条 件下所需的样品量为： oINADEQUATE 200mg (400mM) o 1H-13CCOSY 510mg(20mM) oCOLOC 510mg(20mM) oHMQC 1mg(5mM) oHMBC 23mg(7m

27、M) o因此这两种方法为分子量大的微量样品的测定提 供了广阔的前景。 1。HMQC (1-bond CH correlation) 1H检测的异核多量子相干谱 oHMQC是将1H信号的振幅及相位分别依13C 化学位移及1H间的同核化学偶合信息调制 ，并通过直接检测调制后的1H信号，获得 13C-1H化学位移相关数据。它所提供的信 息及谱图与1H-13CCOSY完全相同。及图上 的两个坐标分别是1H,13C化学位移，直接 相连的13C与1H将在对应的13C化学位移与 1H化学位移的交点处给出相关信号。不能 得到季碳的结构信息。 HMQC of Codeine 13C Assi gnm ent 6

28、.61138 6.51207 5.71333 5.31285 4.8919 4.26610 3.85612 3.35911 3.0 1.19,1.55;3.20,4.46. C38.724.2,51.7),6 个次甲基（5.63,7.18,7.28,7.23,4.93,2.24 C74.1,129.1,128.6,127.1,52.3,35.8),4个季碳。168.8，136.1 ，174.1，166.8). 2.考虑分子对称性 由于化合物的分子式是C36H48O8N4,出现了16个碳信号，小 于二倍。是一个对称分子。 3。确定分子的结构片断 根据1H,13C NMR,COSY ,HMQC确定分子片断。具体分 析可以从最容易辨认的质子（HNMR),剖析 COSY.TOCSY.从HNMR 分析7.18,7.28,7.23 129.1,128.6,127.1，是一个单取代的苯基。 审察化合物的HNMR,COSY可以得到以下结构片断： 4。分子片断的连接 应用HMBC,NOESY将片断连接。 168.8 136.1 37.9 166.8 174.1 羰基 4。分子片断的连接 应用HMBC,NOESY将片断连接。（FIG1) 5.确定立体化学 6。信号归属与验证