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1、第7章 细菌的遗传分析,了解细菌在遗传学研究中的意义及其研究方法 掌握细菌重组的特点以及如何利用中断杂交、转化和转导进行基因定位和作图,1,第一节 细菌的细胞和染色体,一、细菌细胞,细菌细胞比较小，平均每个细胞含有12条染色体，没有核膜，具有拟核,2,细菌染色体大多是双链环状的DNA分子，无蛋白质与之结合； 通常含有一个或多个环状质粒； 比较容易接受其它DNA片段的插入,二、细菌染色体及其遗传特点,3,供体菌和受体菌,DNA片段从供体菌转移到受体菌中，这种转移过程是单向的。,4,内基因子(endogenote)和外基因子(exogenote),5,A genetic exchange occu
2、rs between the main bacterial chromosome and a circular DNA (plasmid) that entered the recipient cell.,6,第二节 大肠杆菌的突变型及筛选,一、大肠杆菌的突变类型,1. 合成代谢功能的突变型(anabolic function mutants),合成代谢功能(anabolic functions)：野生型(wild type)在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必需的有机物的功能。,营养缺陷型(auxotroph)：野生型品系的某个必需基因发生突变，导致不能完成一个特定的生化反应，从而阻碍整
3、个合成代谢功能的实现。,7,野生型菌落,原养型,不同菌落,突变,营养缺陷型,8,2. 分解代谢功能的突变型 (catabolic functional mutation),分解代谢功能(catabolic function):指野生型E.coli能利用比葡萄糖复杂的不同碳源，转化成葡萄糖或其他简单的糖类，也能把复杂的氨基酸或脂肪分子降解成乙酸或三羧酸循环的中间产物的功能,突变型：Lac、ara、 lacZ、 lacY,野生型：Lac、ara 、 lacZ、 lacY,9,3. 抗性突变型,细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗菌素产生抗性(resistant)。,突变型：Strr、T1r,野生
4、型：Strs、T1s,10,细菌中常用的若干突变型基因符号,11,二、突变型的筛选,1. 糖发酵性突变株Lac的筛选,Lac Lac,依红-美蓝 (EMB培养基),2. 营养缺陷型突变的筛选,营养缺陷型突变(X射线、紫外线等),完全培养基,不能生长的菌落,鉴定突变型,基本培养基,印迹法,基本培养基aa,所有菌落,12,第三节 大肠杆菌的性别,1. The discovery of conjugation (接合生殖),In 1946, J.Lederberg & E.L.Tatum discovered that E.coli cells can exchange genetic materi
5、al through the process of conjugation and published in Nature.,13,菌株A和菌株B杂交，产生野生型met+ bio+ thr+ leu+ (出现频率为10-7),这种能够在基本培养基上生长的细菌是由于营养上的互补呢(即一些物质从一个菌株的细胞中泄漏出来而为另一菌株的细胞所吸收)？还是遗传物质重组产生的？,菌株A： met- bio- thr+ leu+,菌株B： met+ bio+ thr- leu-,Davis U-tube,说明野生型是遗传物质交换产生的,15,2. F因子与高频重组,(1) F因子,一种环状DNA分子，610
6、4bp，大约占E.coli染色体全长的2，可编码94个蛋白质分子，与细菌的结合作用有关； 供体细胞含有F因子，称为F菌株，受体细胞不含F因子，称为F菌株；,16,F因子结构图:,F因子包含3个区域：转移起点；致育基因，编码形成F纤毛的蛋白质；配对区，使F因子可以与细菌染色体中多处序列配对，通过交换整合到染色体中。,17,F+菌株与F-菌株的接合,18,F因子的特点:,F因子具有形成性伞毛的基因，使得F与F结合；,F与F、F与F间不结合,FF杂交,19,F因子的繁殖:,细菌分裂使得F细菌产生F细菌，F细菌产生F细菌； F细菌丢失F因子，成为F细菌(acriflavine处理)； F细菌与F细菌混
7、合培养时，F细菌可以转变为F细菌； F与F杂交，只有F因子的传递，细菌的染色体并不转移，二者的重组频率只有10-6，因此F品系称为低频重组系（Lfr）。,20,(2)高频重组(Hfr),In 1950, Cavalli-Stbrza treated an F+ strain of E. coli K12 with nitrogen mustard, a potent chemical known to induce mutations. From these treated cells, he recovered a strain of donor bacteria that underwen
8、t recombination at a rate of 10-4. In 1953, W. Hayes isolated another strain demonstrating a similar elevated frequency. Both strains were designated Hfr, or high-frequency recombination. Because Hfr- cells behave as chromosome donors, they are a special class of F+ cells.,21,Why?,22,23,F细胞得到的只是部分F因
9、子，其余部分依赖于整条Hfr染色体的转移。这样在HfrF-杂交后代大多数重组子仍为F,Hfr细胞和F-细胞之间的接合，一般很少有整条Hfr染色体转入F细胞(pilus容易断裂)，因此：,F受体细胞只接受部分的供体染色体，这样的细胞称为部分二倍体(partial diploid)或半合子(merozygote),24,第四节 中断杂交与重组作图,Wollman and Jacob(1954)设计试验，证明基因从Hfr细胞按次序转入F细胞，可以根据基因进入F细胞的时间和次序制作基因图谱。,一、中断杂交实验原理,F.Jacob,E. Wollman,25,间隔一定时间取样，搅拌以中断杂交，稀释菌液，
10、防止再度配对,基本培养基链霉素,重组子 thr+leu+ strr,中断杂交实验,26,中断杂交实验结果,二、中断杂交作图,27,(T1S),28,致育因子(F+)最后转移到受体，是线性染色体的最后一个单位。,29,不同Hfr菌株进行中断杂交试验，都可以作成连锁图，可是基因转移的顺序、转移起点和转移方向却很不相同。Why?,大肠杆菌的染色体呈环形,30,31,32,重组作图(recombination mapping)是根据基因间重组率进行基因定位,三、重组作图,33,Hfr lac+ ade+ strs lacadestrr F,例如：有两个基因，lac和ade，根据中断杂交试验，知道这两基
11、因是紧密连锁的，而且ade是在lac之后进入F受体的。,34,Hfr lac+ ade+转入受体细胞后的表现,A. 因为供体Hfr转入片断不能独立复制，如果未进入F受体的基因组中去，那么在以后的细胞分裂中就丢失了,B. 如已进入F基因组，而且在缺乏腺嘌呤的培养基上表型为F lacade，表明是这两个基因之外发生双交换的产物，在lacade两基因之间并未发生重组,35,C. 只有在缺乏腺嘌呤的完全培养基上选出lac ade才是其真正的重组子,36,37,重组特点：,高等生物双交换的频率大大低于单交换,微生物则四交换大大低于双交换,利用三点测验定位紧密连锁基因,38,1、a+b+c- a-b-c+
12、(正交组合),2、a-b-c+ a+b+c- (反交组合),关键是确定哪个基因处于中间，a-b-c还是a-c-b？,Donor Recipient,39,cross 1: a+b+c- a-b-c+,cross 2: a-b-c+ a+b+c-,If order is a-b-c, then the frequency of a+b+c+ in cross 1 = a+b+c+ in cross 2; If order is a-c-b, then the frequency of a+b+c+ in cross 1 a+b+c+ in cross 2,42,带有细菌基因的环状F因子称为F因子
13、(F-factor),1. F因子,F因子在细菌染色体上插入位置不同而构成不同的Hfr品系，由此可形成不同的F因子,第五节 F因子和性导,不同的F因子携带细菌的不同基因,如果F因子本身的基因丢失，转移就可能停止,F因子不存在蛋白质外壳的包装问题，可以携带不同长度的DNA片段,F因子和F一样能把F因子转移给F细胞，同时也能转移细菌基因，其结果使F变成F菌株，并形成部分二倍体,F因子的特点：,44,2. 性导(sexduction),性导指利用F因子将供体细胞的基因导入受体形成部分二倍体的过程,HfrF,conjugation,FF,sexduction,45,A Hfr: thr+leu+str
14、s F: thr-leu-strr,B: F: thr+leu+strs F: thr-leu-strr,基本培养基 (strr),筛选出 F：thr+leu+strr,筛选出 F：thr+leu+strr,46,性导在大肠菌株的遗传学分析中的作用,1. 由性导形成的部分二倍体如果不发生重组，则：,47,2. 如果部分二倍体中出现重组，则：,48,三种不同的致育因子的相互关系,F+,Hfr,F,F-,49,50,第六节 转化与转导作图,一、细菌的转化与作图,受体部位(receptor site)：外源DNA片段进入受体细菌形成临时性通道的特定区域,感受态细胞(competence cell)：
15、能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞,感受态因子(competence factor)：促进转化作用的酶或蛋白质分子,外源DNA的转化过程：,双链DNA分子与受体部位进行可逆性结合； DNA分子进入细胞，并要防止受体DNA酶的消化； 双链DNA转变为单链DNA，其中一条链被降解； 另一条链与染色体同源区域形成杂合DNA分子； 杂合DNA经复制、分离后形成子代的转化子。,51,52,利用转化作图,观察两个基因同时转化的频率，判断两者是否连锁； 确定连锁关系后，通过转化后外源片段与受体基因发生重组来确定遗传距离。,同时转化的两个基因不一定都是连锁的，如何判断两个基因是位于同一片段还是位于不同的片
16、段同时转化一个宿主细胞？,稀释10倍后再转化,AB共转化频率也下降10倍,稀释10倍后再转化,AB共转化频率下降100倍,Naster等用枯草杆菌的一个菌株trp2+his2+tyr1+作为供体，提取DNA向受体trp2-his2-tyr2-转化, 计算基因之间的重组值,3个基因的次序为：trp2 his2 tyr1,56,二、转导与作图,转导(transduction)是指以噬菌体为媒介，将细菌的小片段染色体或基因从一个细菌转移到另一细菌的过程,Norton Zinder and Lederberg (1952) were investigating possible recombinati
17、on in the bacterium salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌),LA22:phetrptyr+his+,LA2: phe+trp+tyrhis,57,LA22: phetrptyr+his+,LA2: phe+trp+tyrhis,野生型105,These observations at first suggested that recombination involved was the type observed earlier in conjugative strains of E coli.,58,59,进一步实验过滤因子属大肠杆菌的P22(沙门
18、氏杆菌噬菌体),过滤因子的大小和质量与P22相同,过滤因子用抗P22血清处理后失活,用抗性品系代替LA2敏感品系，在U型管两端均无野生型重组体,LA22是带有P22原噬菌体的溶源性细菌， LA2是对P22敏感的非溶源性细菌,60,Lysogenic LA22 with P22,Few LA22 converts into lytic cycle,Cutting LA2 DNA into fragments,Synthesis of P22s protein,P22 released from LA22 and infects LA2,61,One fragment of LA2 was pac
19、kaged into P22,Defective P22 turns back to infect LA22,DNA from LA2(trp+) was integrated into LA22s chromosome,62,63,64,1. 普遍性转导与作图,噬菌体所携带的供体(细菌)染色体片段是完全随机的，即供体基因组中所有基因具有同等机会被转导形成部分二倍体，经交换和重组后，形成转导频率大致相等的不同转导子，这种转导称为普遍性转导(general transduction),转导,65,共转导或并发转导(cotransduction)：指两个基因同时转导的现象,双因子转导(two-fa
20、ctor transduction)实验：就是每次观察两个基因的转导，通过每两个基因的共转导频率确定这些基因在染色体上的顺序,如果两个基因共转导的频率愈高，表明两个基因连锁愈紧密，相反共转导频率愈低，则表明两个基因距离愈远,66,例如，用大肠杆菌的P1噬菌体进行下列转导实验，测定thr+1eu+aziS的连锁关系,三因子转导：只做一次实验就可以推出3个基因的次序,67,P1噬菌体,基本培养基,哪个图正确？,68,以大肠杆菌trpA+supC+pyrF+细胞作为供体，trpA-supC-pyrF-作受体，由P1噬菌体作为载体进行转导。首先选择supC+,然后检测supC+转导过程中其他两个基因被
21、转导的情况，结果如下：,最难转导，中间发生交换的结果,69,d=L(1-x1/3),两个基因紧密连锁的物理距离为：,d: 同一染色体两个基因之间的图距 L: 转导DNA的平均长度 x: 两个基因之间的共转导频率,71,72,2. 局限性转导与作图,这类噬菌体只能转导供体基因组中的特定基因,如温和噬菌体作为一种附加体，既可以自主状态存在，也可以整合到细菌基因组(特定位置attB处)，形成原噬菌体,The insertion of phage,73,The excision of phage,74,75,局限性转导：这种转导仅限于靠近原噬菌体附近的基因，即噬菌体能专门转导大肠杆菌的gal或bio基
22、因。,转导子（transductant）：通过转导将外源基因整合到自身基因组的受体细胞。,76,接合（conjugation）：两种细菌通过F因子转移DNA的过程。 性导（sexduction）：通过F因子将供体细菌的基因导入受体菌的过程。 转化（transformation）：外源DNA分子直接进入受体细胞的过程。 转导（transduction）：通过噬菌体将DNA转入宿主细胞并产生新性状的过程。 转染（transfection）：外源基因通过病毒进入真核细胞而实现遗传转化。,接合？转化？转导？性导？,77,78,总 结：,细菌是有性别的: F因子(F+/Hfr/F)；供体和受体，单方向传递遗传物质；中断杂交和重组作图(Hfr)；性导(F),细菌重组的特点：偶数双交换；环状整合,转化(外源DNA进入细菌细胞)；转导(利用噬菌体转导细菌DNA的过程),