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1、半抗原免疫分析ABC,1,内容,一、基本概念 抗原 抗体 二、免疫分析方法 分类 ELISA原理与方法 方法建立-苏丹红为例,2,3,抗原 antigen,Ag,4,(一)抗原的概念 抗原(Antigen,Ag) 是一类能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答,并能与相应的免疫应答产物在体内或体外发生特异性结合的物质.,5,(二)完全抗原与半抗原 1.完全抗原（complex antigen): 既具免疫原性又有免疫反应性的物质. 如:大多数蛋白质. 2.半抗原(hapten): 仅有免疫反应性而无免疫原性的物质.如:大多数多糖、类脂、某些药物. 半抗原+载体(蛋白质) 完全抗原,6,共同抗原与交
2、叉反应,8,共同抗原与交叉反应 1.共同抗原(Common antigens)： 存在于两种不同的抗原之间的相同或相似的抗原决定簇，称为共同抗原。 2.交叉反应(Cross-reaction)： 由于存在共同抗原造成抗体对具有相同或相似决定簇的不同抗原发生反应，此称为交叉反应。 检测意义：假阳性（避免） 多残留检测（利用）,9,10,农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防腐剂、植物激素等半抗原 在食品安全、植物学、环境检测等领域，主要是半抗原类物质。,抗体 antibody,Ab,抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁； 两者既是好朋友，又是一对冤家。,一、基本概念,1. 抗体（Antibod
3、y，Ab） 指B淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 存在形式： 膜型（membrane immunoglobulin, mIg） B细胞膜上的抗原受体； 分泌型(secreted immunoglobulin, sIg) 分泌进入体液, 介导体液免疫应答。,二、免疫球蛋白的分子结构,（一）免疫球蛋白的基本结构： 由四条多肽链组成，呈“Y”或“T”型 1.组成： 2条长链，又称重链（Heavy chain，H链）： 含450-550aa，分子量为55-75KD。 2条短链，又称轻链（Light chain，L链）： 含214aa，分子量
4、为25KD。,2.分类、分型： （1）根据重链氨基酸组成、序列及结构的差异，将Ig 分为五类： IgM () 、IgG()、IgA()、IgD()、 IgE() 亚类：IgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA：IgA1, IgA2 IgM: IgM1, IgM2 （2）分两型： 根据轻链氨基酸组成、序列及结构的差异，可将轻 链分为两型：和型 每一Ig单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须 同型。,抗体的制备方法,3.基因工程抗体(GeAb): 第三代抗体 由基因重组技术制备的抗体,称为基因工程抗体。 嵌合抗体 (chimeric Ab) 人源抗体（humanized Ab)
5、 双特异性抗体（bispecific Ab) Fab/ScFV（single chain FV fragment) 单域抗体（single chain Ab),抗体的结构与功能的关系， 所展现出的生物学功能是其结构的完美表演者。,免疫分析技术,内 容 分析方法分类 几种常用免疫分析技术 ELISA 侧流免疫层析 分析方法的建立 分析数据的拟合,常用的免疫标记物质,类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 化学发光物
6、Luminol、lucigenin 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定,2019/2/16,24,一、标记免疫方法分类,1按标记物的种类分,(1)放射免疫分析 (radioimmunoassay，RIA) (2)酶免疫分析 (enzyme immunoassay，EIA) (3)化学发光酶免疫分析 (chemiluminescent enzyme immunoassay，CIZIA) (4)荧光免疫分析法 (fluorescence immunoassay，FIA) 。,2019/2/16,25,2按是否加入分离剂分,(1)均相免疫分析(homogeneous lm
7、munoassay) 在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反应液中结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行测定，故称为均相免疫分析。如酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT) 。 (2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay) 在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者的总浓度。由于这种信号的测定需将反应
8、液分成液-固两相后，才能分别测定，故称为非均相免疫分析。如ELISA(Enzyme linked immunosorbent immunoassay),ELISA简介,（一） ELISA技术的原理,间接法 夹心法 竞争法,夹心法 Sandwich,竞争法,（二） ELISA所用试剂材料,1、固相 2、酶 3、底物 4、缓冲液 5、仪器,1、固定相,聚次亚乙烯,2019/2/16,33,2、最常用的标记酶,1辣根过氧化物酶(HRP):约有50的EIA使用此酶。 2碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定，其活性可用分光光度计或荧光计测量。 36-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): 通常用于
9、均相EIA。 4-半乳糖苷酶(-Gal): 适用于均相EIA和非均相EIA。 5苹果酸脱氢酶(MDH): 多用于尿样的均相EIA。,3、最常用的底物,邻苯二酚(OPC) 四甲基联苯胺(TMB),4、缓冲液,PBS(T) Tris-HCl Na3N是HRP（辣根过氧化物酶）的抑制剂,酶标仪,4、仪器,酶标仪,（三） 免疫分析方法建立 苏丹红为例,Step 1: Hapten and conjugate,Step 2: characterization of conjugate,Step 3: chessboard tiatrion and calibration curve,Step 4: optimizationnonessential,例1、标记抗原浓度对检测的影响,43,例，pH影响,Step 5: sample analysis,Step 6: validation,一个难点：基质效应,基质效应,基质：样品中除了目标分析物外还含有其他的物质，这些物质可能会对检测结果造成干扰，这些干扰成分称为基质，其干扰称为基质效应(matrix effect) （1）基质来源 水、土壤的腐殖质 食品中的蛋白、脂肪等 溶液中作为促溶的有机溶剂等,例1：环境水样的基质效应,49,（2）基质干扰的消除,掩蔽剂（缓冲液调整） 样品稀释 样品前处理：净化,50,