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1、乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证,课程要求,掌握： 乙肝表面抗原的ELISA法定量检测方法； ELISA法方法学评价的方法。 熟悉： 定量检测的酶标仪操作要领； 各种缓冲液的配制。 了解： ELISA检测中的影响因素和注意事项。,试验目的,进行乙肝表面抗原ELISA法定量分析的方法学验证。,试验材料,1 试剂盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，福州蓝图生物工程有限公司出品。 2 仪器及酶标板 酶标仪：Bio-Rad 680 ； 洗板机：Bio-Rad 1575； 超纯水系统：Millipore Elix ； 电热恒温培养箱(DNP-9052):上海精宏实验设备有限公司。,3
2、 溶液配制 0.01M pH7.4的PBS缓冲液： 称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 质控品： 用PBS缓冲液将标准品配制成6、3、1.5ng/ml三个质控品，每质控品1ml。,试验方法,1 标准曲线各浓度的配制 用PBS缓冲液将标准品配制成8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng/ml。,2 测定方法 设计标准品、质控品及空白分配方案； 取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，按需要重新配制； 在相应孔中加入系列标准品、质控品及空
3、白对照，每孔50ul； 37温育30min，洗板4次； 加入酶标抗体，生物素二抗，50 ul/孔； 37温育30min，洗板4次； 加入A、B液,50 ul/孔，37温育15分钟。 加入终止液，50 ul/孔。,3 标准曲线制作及结果计算 酶标板放入酶标仪，盖上盖子； 在电脑上打开Microplate Manager 5.2软件 选择450nm波长（参照波长630nm），设置LAYOUT和报告模式，测定各孔吸收值； 输入标准品各浓度值，以双对数法制备标准曲线，获取各孔的浓度值，打印标准曲线图和计算结果。,ELISA法标准曲线示意图,4 准确度（回收率）计算 按示例表1样式列表并计算回收率。,5 按示例表列表并计算精密度 。,板内精密度,板间精密度,6 检测限（LOD）计算： 取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。,注意事项,标准品和质控品配制要准确。 实验各个环节都很重要，每步操作都要认真。,讨 论,1.实验背景介绍（目的、采用的方法、检测原理、方法学验证的基本知识介绍） 2.本实验的设计及实施特点 3.实验结果分析 4.临床应用及分析,本实验报告要求,按科研论文格式 有摘要和关键词 字数不限 以WORD形式打印，元月18日前集体上交。,