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1、微生物的遗传变异与育种,第八章,本章内容:,基因突变与诱变育种 基因重组 菌种的衰退、复壮及保藏,第一节 基因突变与诱变育种,一、基因突变:,(一)突变类型:,基因突变与诱变育种,细胞形态 形态突变型 菌落形态 营养缺陷型 生化突变型 抗性突变 抗原性突变(包括细胞内部、表面成分的 改变) 致死性突变型(合成关键性酶的基因发生了突变,则表现 出致死突变) 条件致死突变型:如突变为温度敏感型(37死, 25 活) 其它突变型:毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等,按表型分,温度敏感型突变,基因突变与诱变育种,(二)突变的特点:,1)不对应性:环境与变异无对应性 2)自发性:非人为的诱变因素下发
2、生 3)稀有性:生物体的自发突变率为10-1010-12 4)独立性:一个基因的突变对其它基因突变无 影响 5)诱变性:诱变剂可提高突变率10105倍 6)稳定性:突变性状稳定、可遗传 7)可逆性:有回复突变,基因突变与诱变育种,(三)基因突变自发性及不对应的证明:,基因突变与诱变育种,变量彷徨试验: 涂布试验试验: 平板影印培养试验:,自发突变:没有人工诱变因素的参与,生物体的自然突变,1.变量彷徨试验:,1)抗性细胞的出现,是在接触噬菌体之前; 2)喷上噬菌体,仅起淘汰野生型和鉴别抗性株作用; 3)由于甲方高度彷徨,说明突变是随机的。,基因突变与诱变育种,2. 涂布试验,基因突变与诱变育种
3、,1、突变与噬菌体无关; 2、涂布使抗性菌株均匀分布; 3、抗性突变可在任何时间发生, 与噬菌体存在无关。,以上实验用统计学原理间接证明。,3. 平板影印,基因突变与诱变育种,实验表明:从未接触 str 的菌株可发生抗性突变, 分离可得到纯的 str r 菌株。,由此表明:,突变是自发的与环境不对应的。,基因突变与诱变育种,(四)基因突变的机制:(自学) (五)紫外线(U.V)对DNA的损伤及修复: (自学),二、突变与育种,(一)自发突变与生产育种,基因突变与诱变育种,1.生产选育:群体培养中个别的变异个体表现出 生长优势,发现突变种后,随时分离、纯化。 2.定向培育:用特定的环境长期处理某
4、一微生物 群体,同时不断对其移种、传代,以达到积累 和选择合适的自发突变 体的一种育种方法.,3、自发突变的机制:,自发突变(spontaneous):在非人为的情况下由于 遗传 物质的微小变化引起的性状变异。 原因可能是: 1)环境因素; 2)自身有毒产物的积累; 3)互变异构效应; 4)环出效应等。,基因突变与诱变育种,(二)诱变育种,1. 概念: 诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质(DNA)的分子结构发生改变,引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,基因突变与诱变育种,2. 诱变剂:,2)种类: 物理因子(phisical agents) 化学因子
5、(chemical agents) 转座子(transposable elements) 物理诱变剂:U.V、快中子、超声波等。,基因突变与诱变育种,1) 概念:凡能提高基因突变频率的理化因素。,化学诱变剂:,烷化剂 (alkylating agents): 如:氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、NTG等 机制:将烷烃加在含氮碱基上,改变氢键性质 碱基类似物 (base analogs): 如:叠氮胸腺嘧啶(AIT)等; 机制:在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中,而碱 基类似物没有正常碱基的氢键性质,在DNA复 制时出现突变体。,基因突变与诱变育种,插入剂 (intercalating agen
6、ts):,如:溴化乙啶等一些三环分子。 机制:与DNA中的一对碱基有大致相同的位点,这些分子 不改变碱基的氢键性质,而插入在双螺旋中,加宽间 距,引起碱基增加。,基因突变与诱变育种,3. 诱变程序:,基因突变与诱变育种,原始菌种,纯化,斜面/肉汤培养,单孢子/单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异,挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,4. 诱变的主要环节,1)诱变剂的选择:,基因突变与诱变育种,a. 了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法 b. 处理方式: 单一因子处理: 复合因子处理:两种以上因素,先后使用 同时使用 单一因子重复使用,c.
7、 处理剂量:测致死率。,方法,平板菌落计数法 纸片法,一般杀菌率为70%左右。,基因突变与诱变育种,Ames test:对化学诱变剂做检测,菌种:鼠伤寒沙门氏菌 his -; 原理: his -在基本培养基上不长;而发生回复突变则长。,基因突变与诱变育种,Ames test 方法示意图,用于检测食品、饮料、药物和饮水等样品的中致癌物,基因突变与诱变育种,2)出发菌株: 育种的原始菌种;应具备:,对诱变剂的敏感性高; 生产中选育过的自发变异菌株; 本身具有一些有利性状; 对代谢产物有一定积累; 已经发生过某些变异。,基因突变与诱变育种,3)单孢子或单细胞悬液的制备,a. 必要性: 单细胞可以均匀
8、地接触诱变剂 避免出现不纯的菌落菌种退化,基因突变与诱变育种,b. 制备: 物理诱变剂生理盐水(0.85%NaCl) 化学诱变剂缓冲液,c. 方法:,三角瓶内加0.5cm玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80(表面活性剂) 用无菌脱脂棉过滤。,d. 浓度: 细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,基因突变与诱变育种,4)设计和采用效率高的筛选方案和方法,初筛: 平板上做定性、半定量的测定,观察突变株 的生理效应范围。 方法:梯度平板法;(抗性菌株) 纸片法; (抗性菌株) 透明圈法;(淀粉酶产生菌株等) 变色圈法;(氨基酸生产菌株),基因突变与诱变育种,如:用梯度平
9、板法筛选抗性菌株,基因突变与诱变育种,抗生素法直接筛选抗药性突变体,基因突变与诱变育种,复筛:,较精确的生物化学分析方法 做摇瓶测定 (见P250),基因突变与诱变育种,三、营养缺陷型的筛选,(一)概念:,基因突变与诱变育种,1. 三种遗传型个体,营养缺陷型(auxotroph):经诱变产生的一些合成能 力出现缺陷,而必须在培养基内加入相应 有机养分才能正常生长的变异菌株。 如:lys - ; bio - ;,野生型(wild type):自然界分离到的任何微生物,在 其发生营养缺陷突变前的原始菌株,为 该微生物的野生型。如:lys + ; bio + ;,原养型 (prototroph) :
10、指auxo突变菌株回复突变或重组 后产生的菌株,与野生型的表型相同。,2、筛选用的培养基,基本培养基(minimal medium,MM)-:满足野生 型菌株营养要求最低成分的组合。 完全培养基(complete medium,CM)+:满足一 切auxo生长的天然或半组合培养基。 补充培养基(supplemented medium,SM)x:在 MM中有针对性地加入一或几种营养成 分以满足相应 auxo生长的组合培养基。,基因突变与诱变育种,(二)筛选方法,auxo的鉴定,基因突变与诱变育种,诱变处理,auxo的浓缩,auxo的检出,1. 诱变处理(同前),auxo的筛选程序:,基因突变与诱
11、变育种,细菌培养,离心洗涤,诱变处理,CM后培养,洗涤,MM加PN,涂布于CM平板,影印培养,挑取,鉴定,菌种保存,2. auxo的浓缩:,基因突变与诱变育种,1)抗生素法: 原理: 青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞,对休止态细胞无作用。 方法:菌培养在含抗生素的MM基中。,2)菌丝过滤法:,适用于丝状 (放线菌、 霉菌) 原理:基本培养基上只有发育成菌丝;auxo孢子可通过滤膜,野生型菌丝不能通过。,基因突变与诱变育种,3)差别杀菌法:,基本培养基上只有野生型生长,加热杀死野生型营养体,保留auxo芽孢。 细菌80 酵母60 适用于产芽孢、孢子菌。,基因突变与诱变育种,3.
12、auxo的检出,1)逐个检出法,基因突变与诱变育种,2)影印平板培养法,3)限量补充法 (在mm中加0.01%蛋白胨, auxo菌落小,野生型菌落大),基因突变与诱变育种,3)夹层培养法,4. auxo的鉴定,基因突变与诱变育种,1)生长谱法 方法简便; 回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片,混合氨基酸法步骤:,a. 将多种营养因子编组, 如: 一组:1 2 3 4 5 二组:2 6 7 8 9 三组:3 7 10 11 12 四组:4 8 11 13 14 五组:5 9 12 14 15,基因突变与诱变育种,2)混合氨基酸(Vit)法,1)每组内无重复的营 养因子 2)每组中应包
13、含只出 现一次的因子 3)每组中其他因子应 分别出现二次,营养因子分组编排时注意:,基因突变与诱变育种,b. 将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养 c. 结果分析,a. 将多种营养因子编组, 如: 一组:1 2 3 4 5 二组:2 6 7 8 9 三组:3 7 10 11 12 四组:4 8 11 13 14 五组:5 9 12 14 15,5. auxo 的应用,1)作为标记菌株:进行基因工程、诱变育种、 代谢过程的研究中的亲本标记; 2)作为生产菌种:aa、核苷酸等生产菌种; 3)作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,基因突变与诱变育种,第二节 基因重组,本节内容: 原核生物的基因重组
14、 真核生物的基因重组,基因重组:,把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起,经遗传物质重新组合后,形成新遗传型个体的方式。,基因重组分子水平的杂交 一般杂交细胞水平,基因重组,甲 生长快、产量低,乙 生长慢、产量高,基因重组,基因重组,如:,生长快、产量高,一、原核生物的基因重组,(一)转化(transformation),基因重组,受体菌(receptor)直接吸收来自供体菌(donor)的DNA片段,通过交换,将其整合到自己的基因组中,再经复制就使自己变成一个转化子(transformation)。 这种受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象,称转化或转化作用。,概念:,
15、1. 感受态,基因重组,不同菌株的亲缘关系 受体细胞是否处于感受态,感受态:受体细胞最易接受外源DNA片段并实 现其转化的一种生理状态。,不同菌出现感受态的时间不同。,转化的决定因素:,2. 感受态因子,一种胞外蛋白质,分子量为510kD,基因重组,其作用为:,催化转化,促进外来DNA片段吸收 可降解细胞表面某种成分,使DNA受体暴露 1)不同菌细胞DNA受体位点不同 2)有的菌感受态因子只对同种菌起作用,3. 转化因子:,转化因子的本质是供体DNA片段 一般为线状或闭合环状;单链或双链; 转化的频率往往很低,一般为0.11%。 据研究,呈质粒形式(双链闭合环状)的 转化因子,其转化频率最高,
16、基因重组,4. 转化的检出,甲(受体) strr,lys-,基因重组,如出现strr,lys+的菌株,则表明已经转化,乙(供体) strs,lys+,在含str的MM上培养,转化的全过程(以噬菌体为例),基因重组,(二)转导(transduction),以噬菌体为媒介,把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中,通过交换与整合,从而使后者获得前者部分遗传性状的现象,称为转导。获得新遗传性状的受体细胞,称转导子。,基因重组,概念:,转导以温和噬菌体为媒介,其从宿主DNA上诱导裂解时可能有三种情况:,1)包入的完全是噬菌体的DNA(噬菌体) 2)包入的完全是细菌DNA(完全缺陷噬菌体) 3)部分带有噬
17、菌体基因的DNA(部分缺陷噬菌体),基因重组,1. 普遍转导(generalized transduction),1)完全转导(complete transduction): 由完全缺陷噬菌体将外源DNA片段导入受体细胞,经交换、整合、复制形成遗传性状稳定的转导子。 此时受体细胞的特点:a. 不发生溶源化; b. 不显示免疫性; c. 不会裂解产生正常噬菌体。 2)流产转导(abortive transduction): 外源DNA片段不经交换、整合、复制,仅转录、转译和 性状表达。 特点:子代只有一个细胞带有重组子性状。,基因重组,由完全缺陷噬菌体介导的转导现象。,2. 局限转导:,指通过部
18、分缺陷噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中,并获得表达的转导现象。,基因重组,部分缺陷噬菌体: 噬菌体带有宿主gal基因dgal噬菌体 噬菌体带有宿主bio基因dbio噬菌体 特点:a、无正常溶源化能力; b、受体细胞不具免疫性。,根据转导频率的高低,可分为:,1)低频转导(LFT): 部分缺陷噬菌体比例低,获得局限转导子量极少。,2)高频转导(HFT):,双重溶源菌:感染dgal噬菌体后,又感染正 常噬菌体,且同时整合在菌染色体上。,HFT裂解物:诱导裂解双重溶源菌,裂解物 中含等量的两种噬菌体,称此裂解物为。,高频转导:用低感染复数的HFT裂解物感染 另一gal-受体菌时,可高频地将
19、其转化 为gal+转导子,这种方式称,3. 溶源转换与转导的区别(自学),基因重组,(三)接合(conjugation),供体与受体细胞直接接触,借性菌毛传递大段DNA的过程。在受体细胞中发生交换、整合,使之获得供体菌的遗传性状的现象,称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。,基因重组,概念:,(四)原生质体融合(protoplast fusion),使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合,并发生遗传重组以产生融合子(fusant)的过程。,基因重组,已成功地应用与植物细胞、真菌细胞、属间、科间的远缘细胞融合,融合产物含两亲代细胞基因组。,过程:,基因重组,二、真核微生物的基因重
20、组,基因重组,(一)有性杂交,一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组,并产生新遗传型后代的一种育种技术。,凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌,原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。,(二)准性杂交(parasexual hybridization),同种异株的两个体细胞融合,不经减数分裂而导致低频基因重组发生的一种繁殖方式。(单倍体体细胞重组),基因重组,1. 准性生殖,2. 准性生殖的意义:,对一些没有有性过程但有重要生产价值的半知菌来说,进行基因在染色体上定性研究、杂交育种,准性生殖提供了一个重要的手段。 发现存在构巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放线菌中,使之有普
21、遍意义。,3. 过程,1)菌丝联结(anastomosis); 2)形成异核体(heterocaryon); 细胞质、核交流形成异核菌丝体。 3)核配(caryogamy)形成杂合二倍体; 特点:频率低,10-510-7 促成:樟脑熏蒸、紫外、高温 4)体细胞交换和单倍体化,基因重组,半知菌的准性生殖示意图,基因重组,异核体的特点:,1)具有感受性的两种菌丝间才可形成异核体; 2)具有野生型性状,可在基本培养基上生长 ; (基因互补功能) 3)大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基 上生长;如能生长,则为异核体、或为杂合 二倍体(重组子)。,基因重组,异核体:同一菌丝有不同遗传性状的核在同一
22、细胞质中生长。 同核体:同一菌丝中只有一种核。,体细胞交换和单倍体化,杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中,能发生体细胞染色体间的交换、分离(单倍体化)而产生具有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。,A,B,A+B,(同核体),(异核体),A,A,B,B,AB,A,A,B,B,(杂合二倍体),单倍体杂合子,基因重组,4. 检出:,1)若MM和CM上差别不大的,为稳定 的杂合二倍体 2)若MM上不长,CM上大量长,为不 稳定异核体,基因重组,第四节 菌种的衰退、复壮及保藏,一、菌种的衰退和复壮,1.衰退: 概念:菌种经长期的人工培养或保藏,在 其自发突变的影响下,引起某些优良 性
23、状变弱或消失的现象,称为衰退。,菌种的衰退、复壮及保藏,现象:,菌落和细胞形态的改变; 生长速度缓慢,产孢子越来越少; 代谢产物生产能力或其对宿主寄生 能力下降; 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。,衰退的原因: 有关基因负突变,1)多次传代造成负突变数量增加 如斜面保藏: 细菌:1个月 酵母菌:3个月 放线菌、霉菌、芽孢:半年 2)培养条件; 3)诱变时出现不纯菌落。,菌种的衰退、复壮及保藏,2. 防止衰退的方法:,控制传代次数; 选择合适的培养条件; 采用不同类型的细胞进行传代; 采用有效的菌种保藏方法。,菌种的衰退、复壮及保藏,3. 菌种的复壮:,复壮:使衰退的菌种恢复原来优 良性状的方法。
24、,复壮的方法:,1)纯种分离: 菌落纯(划线法、涂布法、倾注法) 菌株纯(单细胞挑取法) 2)通过寄主体进行复壮; 3)淘汰已衰退的个体。,菌种的衰退、复壮及保藏,二、菌种保藏:,1. 目的:,存活,不丢失,不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种,2. 原理:,创造一定条件,尽可能降低微生物代谢活动强度,使之基本上处于休眠状态。,条件:1)挑选优良纯种的休眠体; 2)创造适合长期休眠的环境条件(干燥、低温、 缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等),菌种的衰退、复壮及保藏,3. 方法:,1)暂时保藏法斜面保藏,方法:斜面置4冰箱保藏,定时传代 原理:低温下,微生物代谢强度明显下降
25、优点:适用于各种微生物、简便易行、易 于观察; 缺点:保藏时间短、传代频、易退化、易 污染、工作量大。,改良方法:橡皮塞取代棉塞、加矿油,菌种的衰退、复壮及保藏,2)长期保藏法,方法: 砂土管法 真空冷冻干燥法 液氮法,原理:运用干燥、低温和隔绝空气等手段,降低 微生物菌种的新陈代谢速率,使菌种的生 命活动处于半永久性的休眠状态,以达到 长期保存的目的。,菌种的衰退、复壮及保藏,1)砂土管法:,干法:(适用于部分真菌、放线菌)将斜面上 孢子刮下,接种于无菌砂土管中(砂 装试管2/5),搅拌均匀。 湿法:斜面中加35ml无菌水制成菌悬液,取菌 悬液10滴加入砂土管,以管内砂全部湿 润为宜。,将砂
26、土管置于干燥器中真空干燥,低温或室温下保藏 适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏。 保藏时间几至几十年。,菌种的衰退、复壮及保藏,2)真空冷冻干燥法,原理:加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥, 使微生物细胞处于半永久的休眠状态,以达到长 久保藏的目的。 方法:用无菌脱脂牛奶作保护剂,加入3ml于斜面中制成 菌悬液,分装在安瓿中速冻真空干燥。 真空度维持在0.10.3mmHg,悬液维持冻结状, 水分不断升华,至菌体混合物呈疏松状,熔封。 优点:适用于各种微生物;便于大量保藏;可避免污染, 菌种存活时间长(几到几十年) 缺点:手续繁琐。,菌种的衰退、复壮及保藏,3)液氮超低温保藏法:,方法:用10%甘油、二甲亚砜或蔗糖和吐温80 作保护剂,将菌种分散于其中,或将长 菌的琼脂块放入保护剂中,熔封后迅速 降温至-35。预冻后保存在液氮超低温 冰箱中( -196)。 优点:适用于各种微生物的较理想的保藏方法 缺点:需专门设备 使用时速融,30 40水浴摇动,融后 以无菌手续开启,菌种的衰退、复壮及保藏,