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1、课件地址 ftp:/211.86.156.10 -本科生课件 -公选课 用户名:biox 密码:ustc,RNA interference (RNAi),RNA干涉 从发现到获诺贝尔奖,中心法则,基因表达调控的基本概念,gene expression ：基因转录及翻译的过程。对这个过程的调节就称为gene regulation 。,组成性表达(constitutive expression) 适应性表达(adaptive expression）,基因表达的方式,组成性表达：,指不大受环境变动而变化的一类基因表达。,某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekee
2、ping gene)。,适应性表达 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene)； 相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为可阻遏的基因(repressible gene)。,基因表达的规律 时间性和空间性,时间特异性（temporal specificity）,空间特异性(spatial specificity),基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称
3、细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。,在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性。,基因表达调控的生物学意义,适应环境、维持生长和增殖（原核、真核） 维持个体发育与分化（真核）,通常人们了解的RNA分子莫过于信使RNA（mRNA）、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)这三种经典意义上的RNA分子，它们行使中心法则规定的RNA分子的生物学功能。,现今涌现出了一大批小RNA分子，包括核小RNA分子(small nuclear RNA,snRNA)、核仁小RNA分子(small nucleolarRNA,s
4、noRNA)、微小RNA分子(microRNA,miRNA)、和小干扰RNA分子(small interfering RNA,siRNA)等等。这些小RNA分子都包含小于500个核苷酸，尤其是miRNA和siRNA都只含有2123个核苷酸。,体内小RNA作用的重新认识,小RNA分子的大量发现和对其特殊生物学功能的认识动摇了中心法则的统治地位。RNA不光是遗传信息从DNA到蛋白质的中间媒介，RNA还可以独当一面，在细胞生命活动中起到不可替代的作用。 例如，snRNA在前体mRNA的剪接成熟过程中起作用，snoRNA则能够对其他RNA分子进行加工修饰，而miRNA可以结合到目标mRNA的3端非编码
5、区进而调节目标mRNA的翻译，siRNA则可以结合到目标mRNA上与之序列互补的区域，指导核酶将目标mRNA特异性降解掉。所有这些新的功能，颠覆了人们关于RNA的功能的传统认识。,New roles for RNA,2006年10月2日瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布，将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学安德鲁法尔和克雷格梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰现象。法尔和梅洛将分享一千万瑞典克朗的奖金(137万美元、107万欧元)。,RNA干扰获得诺贝尔生理学或医学奖,诺贝尔奖评审委员会发布的公报说： 法尔和梅洛获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动的基本机制”，这一机制为控制基因信息
6、提供了基础性的依据。公报指出，干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。干扰机制的发现使得科学家可以对侵入细胞的病毒进行控制。诺贝尔奖评审委员会指出，干扰机制将来有望应用于临床医学和农业等众多领域，用来开发针对病毒感染、心血管疾病和癌症等的新疗法。,“我隐约觉得是有可能获奖的。但我只有45岁，所以我想或许在一二十年内才会发生。”在接受路透社采访时，马萨诸塞大学教授克雷格梅洛(Craig Mello) 如是说。 斯坦福大学教授安德鲁法尔(Andrew Fire) 今年也只有47岁。,安德鲁菲尔(AndrewZ.Fire) 克雷格梅洛(Craig C.M
7、ello),RNA干扰的发现,安德鲁菲尔(AndrewZ.Fire)、克雷格梅洛(Craig C.Mello) 1998年发现了RNA干扰和基因沉默现象。其论文发表在1998年的NATRUE杂志上。,Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-811.,1998年2月发表
8、于英国自然杂志的一篇RNA干扰论文。不少同行迅速意识到这篇论文的非凡价值。 通常，从研究成果发表到获得诺贝尔奖，需要一二十年甚至更多时间，因为成果的准确性和重要性都需要科学界的反复验证。但法尔和梅洛仅仅等待了8年，其获奖速度之快实属罕见。,RNA干扰的传奇故事,中心法则 双链DNA 单链RNA 蛋白质,转录,逆转录,翻译,反义RNA,RNA干扰的传奇故事,很早以前，就有科学家在植物中观察到了基因“沉默”的现象。,早在1991年，来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组，将紫色色素基因导入矮牵牛(petunia)植物，目的是想通过增加紫色色素基因拷贝来获得具有更多红花的矮牵牛，结果则出乎他们的预料
9、：有些转基因的矮牵牛却开出部分或全部白花，表明色素合成不是增加了而是减少。事实上，不但导入的基因没有表达，而且植物本身的色素合成基因也受到某种程度的抑制，这种现象当时称为共抑制(cosuppression),法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因“沉默”的原因在于RNA干扰。 实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在线虫中观察到(RNA干扰)这种特别现象的是康奈尔大学研究生郭苏。 1995年，从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲斯(Kenneth Kemphues)指导下，试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因时，意外地发现反义和正义这两种单链RNA都阻断了该基因的表达。,但可惜的是，她和坎菲斯
10、一直没能解释这个奇怪现象。直到3年后，当时在卡内基研究所供职的法尔和梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所得RNA污染了微量的双链RNA，而经过纯化的双链RNA能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是RNA干扰。 郭苏目前在旧金山加州大学任职。她说：“他们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑的现象，是一个飞跃我和坎菲斯通过话，我们的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，也都认为安德鲁法尔和克雷格理应获奖。”,在实验时，要认真观察每个现象，发现怀疑并给予证明，不要被误导。,法尔和梅洛等人的研究发表以后，激发了全球研究人员对RNA干扰领域的兴趣。 2001年和2002年，美国科学杂
11、志连续将RNA干扰列入年度十大科学进展 。,RNA干扰的基本原理,RAN干扰的发现实验 RNA干扰的细胞生物学途径,RNAi的发现,1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。,RNAi的提出,直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时
12、发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。,Double-stranded RNA,inject,C. elegans,control: not stained,wt + antisense RNA,sense,antisense,Nature 1998 391:806-811,Mex-3 mR
13、NA detection in embryos by in situ hybridization,wt,wt + ds RNA,RAN干扰的发现实验,RNAi广泛存在于自然界,随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。,Dicer： A specific RNAase III enzyme,RISC*：active forms of RISC complex,RISC
14、 （RNA-induced silencing complex）,RNA干扰的细胞生物学途径,siRNA,Model for RNAi,Dicer contains two RNAse III domains,siRNAs,long dsRNA,Guide RNAs Small 22 nucleotide RNAs associate with RISC,siRNAs have a defined structure,RNAi silencing complex,may be associated with translating ribosomes,active RNAse enzyme n
15、ot yet identified,RISC (RNA-induced silencing complex) Effector Nuclease - RISC contains siRNA - precurser activated by ATP - find and destroy mRNA of complementary sequence - contains endo- and exonuclease, cleaves the hybrid in the middle imm. followed by degradation - ARO: PAZ domain,RISC nucleas
16、e complex,Latent RISC Precursor RISC 250K associate with ds siRNAs +ATP Active RISC Active RISC 100K (siRNA unwinding) associate with ss siRNAs destroys target mRNAs,Hannon Review,RISC nuclease complex,外源或内源产生的dsRNA进入细胞后，在核酸酶(Dicer)作用下被切割成3 端有2个碱基突出的2123 nt长度的小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)；
17、这些siRNA与RNAi特异性酶结合，形成RNA诱导沉默复合体(RNAinduced silencing complex，RISC)；而后RISC在siRNA反义链的指导下与siRNA 同源靶RNA相结合，并在近中点位置将其切割，达到抑制靶基因表达的作用,RNAi是指将外源双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)导人细胞后引起与其序列同源的特异基因mRNA 降解的现象，属于转录后基因沉默 (posttranscriptional gene silencing，PTGS)的一种形式。,Amplification of signal: siRNA may work as pr
18、imers on the mRNA Amplification by RNA dependent RNA polymerase,Mechanism of RNAi: Gene Silencing directed by 22nt RNAs,RNA 干扰的应用,基因功能研究 基因治疗,Practical aspects of RNAi,biological research defining gene function (gene knockdown) defining biochemical pathways microarray screening of RNAi knockdowns th
19、erapeutic treatment cancer viral infection parasitic infection,RNA干扰技术应用于哺乳动物 细胞的研究策略,在哺乳动物细胞中，长dsRNA(通常大于30 bp)导入后，会启动细胞内的病毒防御机制，细胞内干扰素产生加大，RNA依赖的蛋白激酶被激活，使翻译起始因子elF2a磷酸化，致使细胞内全部蛋白合成的关闭；同时RNA酶L(RNase L)被激活，产生非特异性mRNA的降解，最终诱导细胞凋亡。 上述因素在一段时间内限制了RNAi在哺乳动物细胞中的应用。2001年Elbashir等首次采用体外合成的21 nt siRNA导入到人胚肾细
20、胞和人宫颈癌细胞(HeLa)，观测到RNAi现象的发生。此后RNAi技术在哺乳动物细胞中的探索与应用逐渐成为研究热点。,RNA干扰技术应用于哺乳动物 细胞的研究策略,在哺乳动物细胞中开展RNAi实验大致包括以下5个步骤： 选取目的基因； 设计相应的siRNA序列； 制备siRNA； siRNA转染哺乳动物细胞； RNAi效果分析。,RNAi研究的一般技术路线,从理论上讲，既然RNA干扰可以使特定的基因“沉默”，就有可能为癌症和艾滋病等顽疾的防治带来革命性的变化。 2003年，哈佛大学利伯曼(Judy Lieberman)副教授与中山大学附属第二医院宋尔卫博士等人在自然医学杂志发表论文，介绍RN
21、A干扰对小鼠急性肝炎的防护作用，被麻省理工学院教授、诺贝尔奖得主夏普(Philip Sharp)称为“首次在整体动物疾病模型中显示RNA干扰的治疗作用”。 在实验中，未接受RNA干扰治疗得实验鼠40在3天内死亡。40只接受过治疗得实验鼠有33只活了下来，10天后研究人员检查实验鼠得肝部，发现完全正常。,在基因治疗中的应用,科学家们已经应用RNA干扰技术，在多种不同的动物疾病模型中获得了良好疗效。此外，“6种基于该技术的药物已经在美国进入II期临床试验，这个速度相当快”。 如今这项技术不但在科学研究领域得到广泛应用，可以说“全世界的生物研究所，凡是与基因有关的都在使用这项技术”，而且在制药业和农
22、业等领域也很受关注。,治疗HIV 感染 由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIV病毒感染是我们亟待解决的问题，将RNAi技术应用于艾滋病治疗是顺理成章之事。 针对HIV病毒研究有Jacque等设计的抑制HIV 1长末端重复序列、附件基因vif和nef表达的siRNA，Lee等针对rev转录子设计的siRNA及Novina等针对HIV病毒gag基因设计的siRNA，其基本策略都是选择HIV病毒基因为靶点。,治疗HIV 感染,然而，RNAi治疗HIV，应用于临床，有几个重要问题必须解决： 、作用靶点的选择，siRNA对序列要求非常严格，1个碱基的错配，将大大降低siRNA基因表达抑制作用
23、。如果HIV逆转录酶有较高的错配率(1/1000个核苷酸每个复制循环)，就可能迅速导致所谓siRNA逃逸突变的出现。感染个体中HIV序列的多样性，为siRNA的设计和合成增加了难度。 、如何有效导入siRNA. DNA质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入效果，但在原代细胞中效果较差。 、增强siRNA在细胞中的稳定性.为了防止细胞内RNA酶对siRNA的降解，可以用DNA质粒和病毒载体将siRNA以发夹(hairpins)的形式导入细胞内。,治疗肝炎病毒感染,Jude Lieberman等已经成功地利用 RNAi技术治愈了实验鼠的肝炎。 他们干扰的目标是“凋亡相
24、关蛋白质（FAs）基因”。FAs存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。 据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒激活了FAs基因所导致的。 Jude Lieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默” FAs基因的siRNA，发现有90的肝细胞接收到了这种RNA分子，FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，未接受RNAi治疗的实验鼠有40在天内死亡。而40只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来，10天后研究人员检查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。,治疗肝炎病毒感染,McCaffre A及其导师Kay M结果则证明RNAi可以直接治疗肝炎病毒。 他们首先将HBV的基因组插入
25、到小鼠肝脏细胞中，模拟HBV感染，然后合成靶向HBV基因组不同部分的2种siRNA并分别与表达载体连接后导入感染小鼠。结果发现治疗组小鼠体内肝炎病毒RNA的数量与对照组相比减少了92%。 治疗组小鼠没有发现严重的副作用。 但Kay指出，这种运送siRNA方法不能用于人类。他们正在实验更温和的途径将siRNA运送到细胞中。 对于人来说，身体比老鼠大得多，血液循环系统也庞大。 如果解决了将siRNA有效而又充足地运送到细胞的问题，将为许多疾病和感染提供新疗法。,治疗肿瘤,多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA 。 Brummelkamp 等用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细胞中,特异性抑
26、制了癌基因k ras (v12)的表达。 对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。 Scher 等以引起慢性髓性白血病和bcr ab1阳性急性淋巴细胞白血病的bcr ab1癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87%的有效抑制率。 Wilda等用siRNA抑制白血病bcr/abl融合基因表达也取得了成功。 因此基于 RNAi技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大。,首先，科学家还没有找到一种方便快捷的方法，使RNA干扰能在患者体内的有效部位进行，怎么将RNA干扰药物运送到特定的细胞群体，比如肿瘤细胞，就是一大障碍。比如说，在治疗黄斑变性时，科学家可以直接对患者眼部进行治疗，而对于其他一
27、些疾病就没有这么简单。 其次，科学家还无法确定这种疗法是否会影响目标基因以外的其他基因，引发副作用。,技术障碍,The plot thickens The Discovery of Endogenous Effectors for RNAi,Discovery of the first naturally occurring small RNA specie , lin-4 Non-coding, 22nt RNA Important for larval development lin-4 partially complementary to conserved sites in lin-1
28、4 3UTR Lee et al., 1993 lin-4 binds these sites lin-4 negatively regulates lin-14 translation The naturally occurring small RNA designated microRNAs (miRNAs) No other miRNAs found for 7 years! Second miRNA let-7 Reinhart et al., 2000 Non coding, 21nt RNA Regulates lin-14 in same way as lin-4,Pathway
29、 of siRNAs and miRNAs,Endogenous vs exogenous,在当前研究中，miRNA可以说是热点中的热点。miRNA广泛存在于真核生物中,本身不具有开放阅读框架(ORF)，多数miRNA 具有高度保守性，miRNA 基因不是随机排列的, 其中有一些是成簇的(cluster)，而且簇生排列的基因常常协同表达，大多数已发现的miRNA 的表达都具有时序性。这就意味着miRNA可能参与空间发育、应激性、细胞周期和基因重组等过程。 就在2005年，细胞杂志上发表文章，美国怀特黑德生物医学研究所和马萨诸塞理工学院的科学家发现，人类基因组中大约有三分之一负责蛋白质合成的基因
30、是由miRNA控制的。这一新发现表明，在细胞机制中所起的作用远超出先前的认识。除此之外，科学家在自然杂志上撰文指出，目前已有的研究结果表明，miRNA参与控制果蝇的细胞死亡与增殖、哺乳动物的造血作用、线虫的神经网络分布、以及植物的叶和花的发育。现在，一个新的小RNA在胰岛瘤细胞中被发现：miR-375是胰岛特有的，其过度表达抑制由葡萄糖诱导的胰岛素分泌。miR-375以及其他组织特定的小RNA可能是糖尿病药物治疗的候选目标。 有关miRNA的研究不但对于我们理解细胞活动中复杂而有序的细节从而探索生命的本质有极大帮助，而且会给医疗的发展提供新的思路和方向。可见，关于miRNA的研究将是生命科学研
31、究的前沿和热点.,These “riboregulators“ have two traits ideally suited for gene relulation: 1. Being so small, they can be rapidly transcribed from their genes. 2. They do not need to be translated into a protein product to act (in contrast, e.g., to transcription factors).,New Frontiers for RNA,Small RNAs
32、likely to have bigger impact on gene and protein regulation New classes of small RNAs: PiRNA Small single-strand RNA 26-31nt Discovered in a wide range of eukaryotic organisms Interact with Piwi family proteins Regulate gene silencing, eg. controlling the transcription and translation of transposons and retrotransposons of genome,