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1、乙肝两对半免疫学检测相关问题研讨,中山三院检验科 李林,HBV感染的实验室检测是目前国内最为常见的检验项目，也是医患纠纷产生较多的领域之一。 卫生部临床检验中心 李金明 乙肝两对半： HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb。 检测结果：定性、半定量、定量。 试剂原材料：抗原（天然抗原、重组抗原）、抗 体（单抗、多抗、Fab）。 检测技术： ELISA、化学发光、时间分辨荧光、免疫层析等。 检测方法：夹心法（一步法，两步法），竞争法（固相液相竞争法，液相液相竞争法等）。,一、HBsAg 方法：双抗体夹心法：两步法，一步法。 试剂原材料： HBsAb（ McAb、 PcAb）或
2、其酶解产物 Fab 。,双抗体夹心法模式：,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,HBsAg抗原表位 1、共同决定簇： a（ aa124-147）； 2、型特异决定簇： （1） d/y（ aa122，赖氨酸/精氨酸）； （2） w/r（ aa160，赖氨酸/精氨酸）； 四种亚型：adr、adw、ayr、ayw。,检测中常见的问题,1、一步法测定中的钩状效应（Hook effect）：,一步法检测时，受检抗原的含量很高时， 过量抗原分别和固相抗体及标记抗体结合，而 不能形成 “固相抗体抗原标记抗体”夹心复 合物。此时反应后的检测信号位于抗原过剩带 上，与标准曲线位于抗体过剩带上的某一抗原 浓度的检测信
3、号相同，如按抗体过剩带上的检 测信号测读，所得结果将低于实际的含量，这 种现象称为钩状效应。钩状效应严重时，可出 现假阴性结果。,双抗体夹心一步法的钩状效应（示意图）:,固相载体,固相Ab,Ag,标记Ab,钩状效应时分析浓度与检测信号关系图：,检测信号,抗体过剩带,抗原过剩带,抗原分析浓度,HBsAg检测试剂原材料与钩状反应的关系： 原材料：HBsAb。 多克隆抗体：免疫动物或直接从感染者血清中所获得，来源于不同的B细胞克隆，可含有针对同一抗原分子不同的抗原表位（a、 d/y、 w/r）的多种定向抗体。 单克隆抗体：由一株B细胞杂交瘤产生的只针对某一特定的抗原表位的高度均一，高度专一性的抗体。
4、,McAb制备的试剂受钩状效应的影响较PcAb为轻：,Ig的一个Fab片段只能与一个抗原表位结合。McAb为针 对同一抗原表位的均一抗体分子群。 HBsAg分子虽具有三个 不同的表位(a、d/y、r/w)，但一分子HBsAg同样的表位只有 一个，只能封闭一个单体McAb的一个抗原位点，两分子抗 原才能封闭一个McAb单体。而PcAb为针对同一抗原不同表 位抗体分子群(抗a、抗d/y、抗w/r )，一分子HBsAg上不同的 表位可同时与针对不同表位的两个以上单体PcAb结合，其封 闭作用的效率高于对McAb。,McAb试剂的钩状效应,固相载体,McAb(抗a),Ag,标记McAb(抗d),PcA
5、b试剂的钩状效应,固相载体,McAb(抗a),标记McAb(抗r),标记McAb(抗d),钩状效应是HBsAg一步法检测时不可避免的现象； 由于钩状效应的存在，一步法检测HBsAg所得到的检测信号无法确定其真实性； 解决勾状效应的根本方法为固相抗体与抗原反应后分离游离抗原，再加标记抗体的两步法检测： 第一步：包被抗体捕获抗原成为固相，然后分离游离抗原；第二步：固相抗原与标记抗体结合，分离液相标记抗体后记录检测信号。,两步法检测：,固相载体,Ab,Ag,标记Ab,两步法检测时目的检测物浓度和检测信号关系曲线,检测信号,分析浓度,易误解为两步法的一步法检测： 1、标本生物素化抗体标记抗体 生物素化
6、抗体抗原标记抗体复合物； 2、加入亲和素包被的固相载体 固相生物素化抗体抗原标记抗体复物； 3、洗涤，判读结果。,2）人抗鼠抗体效应(Human anti-mouse effect, HAMA效应) 对检测的干扰,产生HAMA的原因：,经常接触老鼠； 肿瘤病人进行鼠单克隆抗体的治疗。,用鼠源McAb检测HBsAg时，如样品中有 HAMA，就会产生假阳性或假阴性。,非鼠源的PcAb可消除HAMA效应， IgFab（Fab)可消除HAMA引起的假阳性 。,HAMA效应的假阳性模式：标本中的人抗鼠抗体分别与固相HBsAb和标记HBsAb McAb结合，形成固相HBsAbHAMAHBsAb复合物（双抗
7、原夹心），提供假阳性检测信号。,固相载体,固相McAb,标记McAb,人抗鼠抗体,Human Anti-Mouse Antibodies (HAMA),HAMA效应的假阴性模式:,Figure 3-6 How HAMA generates a false negative,3) S基因突变引起的HBsAg漏检：,基因突变引起“a”决定簇内部一个或多个 氨基酸置换、缺失或插入，HBsAg 蛋白质氨 基酸组成发生改变，导致其抗原性产生变化。 变异率高 ，自然变异和免疫逃避，变异无 地域性。 HBsAg抗原性发生改变，不能被野生型 HBsAb所识别。 此时用一般的国产试剂盒可能 检不出。,能导致HB
8、sAg阴性的S区变异 145甘氨酸 精氨酸 aa124 半胱氨酸 酪氨酸 aa129 谷氨酸 天冬氨酸 aa131 苏氨酸 天冬氨酸 aa131 蛋氨酸 苏氨酸 aa122-124 插入氨基酸 前S1/S2部分缺失 不一定HBsAg抗原性发生改变后就一定漏检。很多时候野生型与突变型是混合存在的，这种情况虽然有突变，同样可以检出 。,4)RF引起的假阳性 RF是一种自身抗体，能和多种动物IgG的Fc段结合。由于固相抗体和标记抗体均为IgG，双抗体夹心法测抗原可能有RF的干扰，产生假阳性。,固相载体,固相IgG,标记IgG,RF,解决办法： 用IgG的Fab 或F(ab)片段作酶结合物替代完整的I
9、gG； 标本用联有热变性IgG的固相吸附剂(G蛋白)处理； 将热变性IgG加入到标本稀释液中； 离心分离IgM和IgG； 加入羊抗人IgG。 鼠源单克隆抗体对RF的亲和力较低，也能明显地降低RF对结果的干扰。,McAb和PcAb在HBsAg检测中的应用,McAb： 优点：在一步法检测中能减轻钩状效应；便 于人为处理和质量控制。 缺点：HAMA效应，灵敏度比不上PcAb。,PcAb： 优点：免疫反应性好于McAb，作为标记抗体， PcAb可能提供更强的检测信号，达到更高 的灵敏度；非鼠源PcAb 无HAMA效应。 缺点：一步法检测时钩状效应明显。,固相载体,HBsAg McAb （“a”）,HB
10、sAg McAb （“a”）,标记McAb （抗“d”）,标记PcAb（抗“r”）,McAb和PcAb在检测HBsAg（adr）时抗原 抗体结合示意图,标记PcAb （抗“d”）,HBsAg,标记McAb （抗“d”）,上述情况是指只采用一种McAb的情况，如果采用两种针对不同表位的McAb ，可以提高灵敏度，但同时也和PcAb一样，会发生明显的钩状效应。,常见HBsAg检测情况： ELISA 检测模式：一步法。 原材料：McAb； 检测结果：定性。 缺点：钩状效应，灵敏度较差，HAMA干扰、RF干扰，不能定量。 化学发光 检测模式：一步法。 原材料：McAb(Fab)； 检测结果：定量。 灵
11、敏度好于ELISA，无RF干扰。 缺点：钩状效应， HAMA干扰，定量结果不能溯源到国际标准。,Abbott 检测模式：两步法。 原材料：McAb(固相捕获抗体），PcAb（ Fab，标记抗体） ； 检测结果：定量。 优点：1）无钩状效应；2）无HAMA、无RF干扰； 3）灵敏度高； 4）加用了针对不同突变株病毒 抗原的检测抗体，可以进行HBsAg突变株的检 测； 5）定量结果可溯源到国际标准。 时间分辨荧光 检测模式：两步法。 原材料：McAb(固相捕获抗体），PcAb（ 标记抗体） ； 检测结果：定量。 特点：无钩状效应；灵敏度高；无HAMA干扰。不能进行HBsAg突变株的检测, 可能有R
12、F干扰，定量结果不能溯源到国际标准。,目前国际上常用的HBsAg标准物质： Paul Ehrlich Institute 参考物: PEI/ml; 法国参考物： ng/ml; 雅培参考物： ng/ml（Axsym), IU/ml (i2000)； NIBSC参考物：IU/ml. （英国国家生物标准与检定所，National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC) 1 IU/ml=0.58PEI/ml=1.93“法国”ng/ml=5.59雅培ng/ml,二、HBsAb 原材料：HBsAg 1、天然HBsAg ：血源的纯HBsA
13、g，即S 蛋白（小球形颗粒）；,HBsAg小球型颗粒（2022nm） Dane颗粒（40 42nm) 管型颗粒,2、基因工程重组抗原（rHBsAg)。,HBsAb为分别针对HBsAg五种表位（a、 d/y 、w/r） 的不同抗体，其中90%的HBsAb为针对“a”的抗体，为最 重要的保护性体，对不同亚型感染均有保护作用（但交 叉免疫不完全），也是HBsAb各种抗体中最重要的血清 标志物。 用于检测HBsAb的抗原，无论天然抗原或重组抗 原，必须具有“a”表位，一般为ad、ay亚性联合应用。 HBsAb试剂原材料质量优良，检测方法为双抗原夹心 法，定量定性检测的结果均准确可靠。,可能出现的问题：
14、 如包被物和酶标记物均使用血源球形颗粒，在提取过程中混入Dane颗粒会影响检测结果的特异性 。 原因： Dane颗粒核心结构中的HBcAg暴露； HBcAg降解为HBeAg抗原。,乙型肝炎病毒（Dane颗粒）结构模式,L蛋白,M蛋白,S蛋白,C蛋白,Dane颗粒暴露的HBcAg和降解生成HBeAg在制 备的试剂中也同时作为固相抗原和标记抗原。此时 检出的HBsAb，可能并非真阳性，而是HBcAg或/和 HBeAg夹心检出的HBcAb或/和HBeAb。,固相载体,HBsAg,HBsAb,标记HBsAg,HBcAg,HBcAb,标记HBcAg,假 阳 性 结 果,此时HBsAb假阳性结果将使两对半
15、检测 模式产生误差： 1、HBsAg+HBsAb+HBeAg+HBcAb阳性； 2、HBsAg+HBsAb+HBeAb+HBcAb阳性。,HBsAg阳性+HBsAb阳性模式讨论 在HBV感染及机体免疫过程中，可能有HBsAg和HBsAb同时存在的短暂过程，但很难出现在检测过程中： HBsAg过剩时，HBsAb与其结合，以抗原抗体复合物形势存在，血中测不到游离抗体。 HBsAb过剩时，HBsAg以抗原抗体复合物形势存在，血中测不到游离抗原。 由于抗原抗体反应是可逆的，在检测灵敏度大幅提高的情况下，上述情况不能绝对化。,HBsAg阳性+ HBsAb阳性+HBcAb阳性模式解释：“不同亚型HBV感染
16、” 。 两株不同亚型HBV感染及机体免疫过程：1、两株不同亚型HBV同时或先后感染同一个体，合成两种不同亚型的HBsAg1和HBsAg2；2、前者刺激机体产生HBsAb1，后者未刺激机体产生HBsAb2；3、 HBsAb1中和了相应的HBsAg1而不能中和HBsAg2 , HBsAg2与HBsAb1同时存在。,出现HBsAg和HBsAb同时阳性应具体分析： 90%的HBsAb为针对“a”的抗体，对不同亚型感染均有保护作用，虽然交叉免疫不完全，但出现机率极低； 如因不同亚型HBV感染，交叉免疫不完全，而出现HBsAg和HBsAb同时阳性，此时一般试剂也无法检出(用于检测HBsAg的HBsAb中，
17、并无针对特殊亚型HBsAg的HBsAb)； 更为合理的解释是：部分HBV的S基因突变引起“a”决定簇氨基酸组成发生改变，导致其抗原性产生变化，野生株抗HBs不能将其清除。 进口试剂可能检出。,常见HBsAb检测情况： ELISA 原材料：天然抗原。 检测模式：一步法。 检测结果：定性，半定量。 缺点：可能出现假阳性，定量不准。 化学发光 原材料：天然抗原。 检测结果：定量。 检测模式：一步法。,Abbott 原材料：重组抗原。 检测模式：两步法。 检测结果：定量。 时间分辨荧光 原材料：天然抗原。 检测模式：两步法。 检测结果：定量。,三、HBeAg 原材料：McAb HBeAb。 检测方法：
18、双抗体夹心法(一步法，两步法)。 目前HBeAg检测中，存在明显的假阴性结果： 1、一步法检测钩状效应(主要原因)； 2、灵敏度差。 HBeAg是诊断、治疗检测、预后估计重要的指标，但目前的阴性结果并未引起足够的重视。,常见HBeAg检测情况： ELISA 检测模式：一步法。 钩状效应明显，HAMA干扰，灵敏度不理想。 化学发光 检测模式：一步法。 灵敏度好，钩状效应较ELISA为轻， HAMA干扰。,Abbott 检测模式：两步法。 无钩状效应，灵敏度好， HAMA干扰轻。 时间分辨荧光 检测模式：两步法。 无钩状效应，灵敏度好于ELISA， HAMA干扰。,四、HBeAb 方法：竞争法。
19、原材料：1 ）McAb HBeAb; 2 ） rHBeAg。 存在问题： 原材料：大肠杆菌表达的基因工程抗原 (rHBeAg/E.coli)： 优点：稳定性好，使用安全，价格低廉 。 缺点：特异性差。 1、与HBcAg间存在明显的交叉抗原性 ； 2、菌体杂质干扰检测。,HBeAg和HBcAg是基因同源性很高的两种抗原，但具有完全不同的抗体结合表位。由于E.coli在蛋白合成后处理上与肝细胞的差别，rHBeAg/E.coli存在明显的HBcAg免疫反应性 。 很多人感染过大肠杆菌，血清中的抗大肠杆菌抗体能与重组抗原中的宿主成分结合。,（2）检测模式： 由于检测抗原特异性差，不能采用双抗原夹心法、
20、间接法、捕获法等反应模式。,固相载体,HBeAg/E.coli,HBcAb,标记HBeAg/E.coli,Ag/E.coli,抗E.coli抗体,标记Ag/E.coli,夹心法时的假阳性结果,固相载体,HBeAg/E.coli,HBcAb,标记抗人IgG,Ag/E.coli,抗E.coli抗体,标记抗人IgG,间接法时的假阳性结果,解决办法：采用HBeAb McAb为参比抗体，用竞争法检测HBeAb，避免样本中HBcAb及抗大肠杆菌抗体的干扰：,固相载体,HBeAg,HBcAb,标记HBeAb,抗E.coli,Ag/E.coli,阴 性 结 果,HBeAb检测模式：,两步法： 1、固相抗体标本
21、中和试剂（ rHBeAg ）分离 游离抗原； 2、加入标记抗体分离游离标记抗体，测定固相抗 体抗原标记抗体提供的检测信号，判读结果。,经典方法: 避免中和试剂抗原和标本中可能存在的HBeAg 对标记抗体(HBeAb)的中和作用而引起的假 阳性结果。,1）固相-液相竞争法,固相-液相竞争法检测HBeAb,固相载体,HBeAb,标记HBeAb,rHBeAg 中和试剂,阴 性 结 果,.,固相-液相竞争法,固相载体,rHBeAg 中和试剂,HBeAb （标本）,固相HBeAb,标记HBeAb,阳 性 结 果,2）液相-液相竞争法,一步法： 固相抗原标本标记抗体分离游离抗体测定 固相抗原标记抗体提供的
22、检测信号，判读结果。 优点：操作简便，节约时间。,缺点：当检测标本中存在较高浓度的HBeAg 时，可能与液相中与标记抗体结合，封闭标记 抗体的抗原结合位点，不能形成固相抗原-标记 抗体免疫复合物，导致假阳性结果。,液相-液相竞争法检测HBeAb,固相载体,rHBeAg,HBeAb,标记HBeAb,阳 性 结 果,液相-液相竞争法检测HBeAb,固相载体,rHBeAg,酶标HBeAb,阴 性 结 果,液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg对检测结果的干扰,固相载体,HBeAg(标本）,rHBeAg）,标记HBeAb,液相-液相竞争法竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg对检测结
23、果的干扰,固相载体,HBeAg(标本）,rHBeAg,标记抗体,假 阳 性 结 果,3）固相-液相-液相竞争法：,一步法： 固相抗体标本中和试剂标记抗体分离游离 抗原、抗体测定固相抗体抗原标记抗体提供 的检测信号，判读结果。,缺点：除了检测标本中的HBeAg可干扰检测结果， 还有液相中的中和试剂rHBeAg的干扰，二者可协 同封闭标记抗体的抗原结合位点，导致假阳性结 果。rHBeAg与HBeAg的作用相加，对检测的干扰 可能比液相-液相竞争法更严重。,.,固相-液相-液相竞争法,固相载体,rHBeAg 中和试剂,HBeAb（标本）,固相HBeAb,标记HBeAb,阳 性 结 果,固相-液相-液
24、相竞争法检测HBeAb,固相载体,HBeAb,HBeAb（标本）,标记HBeAb,rHBeAg 中和试剂,阳 性 结 果,固相-液相-液相竞争法检测HBeAb,固相载体,HBeAb,标记HBeAb,rHBeAg 中和试剂,阴 性 结 果,固相-液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg及中和试剂rHBeAg对检测结果的干扰,固相载体,HBeAb（包被）,HBeAg(标本）,rHBeAg 中和试剂,标记抗体,固相-液相-液相竞争法检测HBeAb时，标本中的HBeAg及中和试剂rHBeAg对检测结果的干扰,固相载体,HBeAb（包被）,HBeAg(标本）,rHBeAg 中和试剂,标记抗体
25、,假 阳 性 结 果,固相-液相竞争法检测HBeAb时，避免了标本中的HBeAg及检测抗原对检测结果的干扰,固相载体,HBeAb（包被）,HBeAg(标本）,rHBeAg 中和试剂,标记抗体,阴 性 结 果,HBeAg与HBeAb的临床意义： HBeAg与Dane颗粒、HBV DNA有伴随关系，是HBV DNA复制活跃的血清学指标。HBeAg阳性，说明传染性强。 急性肝炎病人血清HBeAg阳性持续三个月以上，说明疾病有慢性化倾向。,HBeAg-HBeAb血清转换 (HBeAg 消失anti-HBe 出现) 是HBeAg阳性的慢肝病人长期缓解的标志,在慢性乙肝感染期间, HBeAg 的存在与肝脏
26、疾病的活动及进展相关； HBeAg血清转换 与以下相关 : HBV DNA下降; ALT 转为正常 临床缓解 组织学上表现炎症活动减轻 HBsAg 血清转换(HBsAg 消失anti-HBs 出现) 持久的 HBeAg血清转换 (自发的或干扰素诱导)提示有较好的长期预后 (生存率和无病存活率）,HBeAg和HBeAb是病情评估、治疗监测、预后估计的重要指标。 高浓度HBeAg在一步法检测中会出现假阴性，也会导致液相液相竞争法及固相液相液相竞争法检测HBeAb时的假阳性，二者是有因果关系的两项误差。 由于HBsAg/HBeAg阳性与HBsAg/HBeAb阳性两者均是常见的血清学检测模式，上述误差
27、不易引起重视。 两种模式所提示的临床意义完全不同。一步法试剂在检测高浓度HBeAg标本时，可能提供了虚假的HBeAg血清转换的病情信息，对临床医生产生了误导。,常见HBeAb检测情况： ELISA 检测模式： 一步法：1、液相-液相竞争法， 2、固相-液相-液相竞争法。 如标本中含HBeAg时，明显干扰检测结果，浓度高时易出现假阳性。 化学发光 检测模式：固相-液相-液相竞争法（改良一步法）。 标本中的HBeAg仍将干扰检测结果，但较ELISA轻。HBeAg很高时，也会出现假阳性结果。,Abbott 检测模式：固相-液相竞争法(两步法)。 避免中和试剂rHBeAg和标本中HBeAg对标记抗体H
28、BeAb的中和作用，也避免了由此引起的假阳性结果。,五、HBcAb 方法：竞争法(液相-液相竞争法、固相-液相竞争法)。 原材料：1 ）McAb HBcAb; 2 ）rHBcAg/E.coli。 存在问题：1) rHBcAg/E.coli)与HBeAg间存在明显的交叉抗原性 ，特异性差； 2）菌体杂质干扰检测； 3）标本中的干扰成分。,由于血清中不存在HBcAg，反应模式的选择对结果影响不大； 阳性检出率与标本的稀释倍数关系密切； HBcAg免疫原性强，刺激机体产生HBcAb的时间早，滴度高，持续时间长。 有文献报到HBV感染者可表现为HBcAb单项阳性。但一般认为其临床诊断价值不如HBsAg
29、 、HBeAg及HBV DNA。,小结： 目前乙肝两对半检测结果的准确性普遍不如人意。 制备免疫试剂的生物原材料多种多样，是免疫检测的物质基础。试剂生物原材料质量的好坏和检测模式的优劣，决定了检测质量所能达到的水平。 影响结果准确性基本的原因：1、检测方法；2、试剂生物原材料的质量。为提高检测结果准确性，应注意各品牌的试剂以上指标的评估。 不同的生物原材料和检测模式，各有特点。掌握这些特点，了解其影响检验结果的机理，可以帮助我们客观地分析和评估检测结果，为临床提供正确的诊疗信息，同时也能化解一些检验科的医疗纠纷。 警惕常见误差的发生。对可疑结果，认真分析，选用不同试剂、方法进行比对。,谢谢！,