五++氨基酸发酵机制.ppt

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1、第五章 氨基酸发酵机制 全世界AA的年需求量以10%的速度增长，年总产量120万吨以上，而其需求量达800万吨，作为食品添加剂占40%，饲料添加剂占40%，医药保健品占20%。年产值已接近600亿美元。 氨基酸主要用于食品、医药、农业、化妆品等方面。 在食品工业上的应用：甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸具有酸味，谷氨酸钠、天冬氨酸钠具有鲜味，它们都可用作食品添加剂。赖氨酸、蛋氨酸等人体必需的氨基酸常作为食品添加剂，用以提高食品的营养价值。饲料工业作为饲料添加剂的氨基酸有蛋氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、甘氨酸、丙氨酸和苏氨酸7种。,新型甜味剂-蛋白糖 http:/ 新型甜味剂阿斯巴甜又名蛋白糖

2、，是天门冬氨酸和苯丙氨酸合成的二肽甜味剂，是一种相当蔗糖甜度200倍的低热值高甜度的新型甜味剂。它具有安全、易吸收、不致龋齿等优点，可供糖尿病患者及忌糖者的婴幼儿食用，是老年营养食品和保健食品的优良甜味剂；可以制成新型糖的替代品直接加入饮料或食品中；大量用于饮料，果酱、口香糖、乳制品、罐头、蜜饯婴幼儿食品等多种食品中，至今已有3000多种食品使用阿斯巴甜。 该产品在法国首次批准使用，目前世界已有80余个国家和地区批准使用，仅欧美国家年需求量约6000-7000吨，据预测近期世界市场每年将以20的速度增长。我国80年代开始了该项目研究工作，亚运会期间在我国首次将国产阿斯巴甜用于“真珠陈皮”的唯一

3、甜味剂，取得成功。,在医药工业上的应用：氨基酸在医药上的应用很广。例如，氨基酸的混合液可供病人注射用，氨基酸的混合粉剂可作宇航员、飞行员的补品。 在化妆品生产中的应用：氨基酸及其衍生物与皮肤的成分相似，具有调节皮肤pH和保护皮肤的功能，现已广泛用于配制各种化妆品。例如，胱氨酸用于护发素中，丝氨酸用于面霜中。 在农业上的应用：赖氨酸、蛋氨酸添加在饲料中，能加速家畜、家禽的生长，改善肉的质量。 氨基酸也用于其他方面：例如，聚谷氨酸用于合成人造皮革和涂料。,第一节 氨基酸发酵的代谢调控,正常情况下微生物自身不能累积氨基酸，因此要打破微生物的正常代谢调节途径。 经常采用的几种方法： 1、控制旁路代谢：

4、 以D-苏氨酸为底物发酵 D-苏氨酸 L-苏氨酸 脱氢酶 脱氢酶 a-酮基丁酸 反馈抑制 L-异亮氨酸,2、降低反馈作用物的浓度： 谷氨酸 N-乙酰谷氨酸 N-乙酰-Y-谷氨酰磷酸 鸟氨酸 反馈抑制 瓜氨酸 精氨酸 谷氨酸棒杆菌缺乏将鸟氨酸转化为瓜氨酸的酶，消除反馈抑制，可用于生产鸟氨酸。,3、控制细胞渗透性： 谷氨酸发酵：当细胞内生物素水平高时，谷氨酸不能透过细胞膜，需加入表面活性剂或青霉素，提高细胞膜通透性。 4、控制发酵的环境： 氨基酸发酵是人为控制环境的结果， 见表5-1 5、促进ATP的积累以利氨基酸的生物合成： 氨基酸的合成需要能量， ATP的积累有利于氨基酸的生物合成。,第二节

5、谷氨酸发酵机制 谷氨酸，学名：-氨基戊二酸；其单钠盐：谷氨酸钠，商品名称味精，是重要的调味品。目前我国味精的年产量已达100万吨，产销量占世界第一位。 早期生产谷氨酸的方法有两种，一是提取法：甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处理可得到谷氨酸；二是蛋白质水解法：将面筋加酸水解，再分离提纯。1957年发酵法生产谷氨酸在日本协和发酵公司投产。,谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300多倍的谷氨酸，研究发现：大量积累并非是当初设想的由于特异代谢途径导致，而是： 代谢调节控制； 细胞膜通透性的特异调节； 发酵条件的适合； 综合调控的结果。,一、谷氨酸的生物合成途径及调节机制,谷氨酸的生物

6、合成途径大致是： 葡萄糖经糖酵解（EMP途径）和己糖磷酸支路（HMP途径）生成丙酮酸，再氧化成乙酰辅酶A（乙酰COA），然后进入三羧酸循环，生成酮戊二酸。酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。即，谷氨酸的生物合成途径包括EMP、HMP、TCA循环、DCA循环和CO2固定作用等。,一）EMP途径、HMP途径 谷氨酸生产菌存在着两种代谢途径：EMP、HMP ；EMP/HMP=90/10，生物素量增加， HMP途径增加（26%，38%）。 二）TCA、DCA和CO2固定作用 1.TCA环（三羧酸循环） KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失 这是菌体生成并积累KGA的关键，从上图可

7、以看出，KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，在KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，只有当体内KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，KGA才得以积累。在有NH4存在下，由谷氨酸脱氢酶催化还原氨基化生成谷氨酸。,2.DCA环（乙醛酸循环） 菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶异柠檬酸裂解酶。该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。 3.CO2固定 体系中如果不存在CO2固定反应，则有：,则 3/2 C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 N + 4 C

8、O2 产率：147 /（180*3/2） = 54.4%,体系中存在CO2固定反应，则有：,则有： C6H12O6 + NH4+ = C5H9O4 N + CO2 产率：147 / 180 = 81.7% 可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。 在许多微生物发酵的过程中，通常需要检测反应器尾气的组成，特别是尾气中CO2的含量，其主要目的就在于分析产物合成期间菌体的代谢途径，有利于指导生产。,三）氨的导入 有三种方式： 酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。 GA产生菌有强烈的L谷氨酸脱氢酶活性 KGA + NH4+ +NADPH = GA + NADP 由天冬氨

9、酸或丙氨酸通过氨基转移作用将氨基转给酮戊二酸而生成GA 。但是谷氨酸产生菌中天冬氨酸转氨酶(GOT)和丙氨酸转氨酶(GPT)活力很低，转氨途径并不重要。 谷氨酸合成酶途径。谷氨酸合成酶对NH4的亲和力比谷氨酸脱氢酶强得多，当环境中NH4浓度很低时，可由谷氨酸合成酶途径合成谷氨酸。细胞内谷氨酸浓度很高时，反馈抑制谷氨酸脱氢酶活性，但不抑制谷氨酸合成酶。,二 细胞膜通透性控制 细胞膜通透性的调节对于GA 发酵时非常重要的，当菌体进入产物合成期时，开始有GA的产生，这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而实现由Glucose 到 GA的高效率转化

10、。可见，改善细胞膜通透性的重要性，如何进行呢？,通常谷氨酸发酵采用的菌种都是生物素缺陷型，而生物素又是菌体细胞膜合成的必须物质，生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。因此，可以通过控制生物素的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。 生物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分磷脂(结构见图5-8)中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径如下：,三、 菌种选育模型与控制方法 控制磷脂的合成 使细胞膜受损（如表面活性剂） 青霉素损伤细

11、胞壁，间接影响细胞膜 通过油酸的合成 控制磷脂含量 通过甘油合成 直接控制磷脂合成,提高细胞膜的 谷氨酸通透性,谷氨酸产生菌的选育： 1.选育生物素缺陷型 生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅酶，生物素促进脂肪酸合成，再由脂肪酸合成磷脂。选育生物素缺陷型菌株，阻断生物素合成，最终导致磷脂合成不足，细胞膜结构不完整，提高细胞膜的谷氨酸通透性。 因此，控制生物素的含量可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的透性、谷氨酸的分泌和反馈调节。 表面活性剂对生物素有拮抗作用，阻断不饱和脂肪酸的合成，使磷脂合成受阻。 青霉素的直接作用在于抑制细胞壁的合成。细胞膜失去细胞壁的保护而发生继发性变化。,2.选育

12、油酸缺陷型： 不饱和脂肪酸是磷脂的组成部分。选育油酸缺陷型，阻断不饱和脂肪酸的合成，并限制外源供给量，就可限制磷脂的合成。 3.选育甘油缺陷型： 该菌株缺失磷酸甘油脱氢酶，由磷酸二羟丙酮合成磷酸甘油的途径被阻断。 4.选育温度敏感型突变株： 找到高温下细胞膜合成有缺损的突变株。 5.其他，如营养缺陷型；药物抗性突变株；敏感型突变株等。表5-5，表5-6,第三节 赖氨酸发酵机制,一、行业介绍： Lys是人体所必需的8种氨基酸之一，（Thr Val Leu ILe Phe Met Lys try，苏、颉、亮、异亮、苯丙、蛋、赖、色），Lys主要来自于动物蛋白质 。 发酵法赖氨酸的生产最早起源于日本

13、，我国80年代中期相继有赖氨酸的发酵生产厂家。80年代赖氨酸食品曾经非常盛行。 http:/ （1）菌种性能的差异，Lys 是菌体代谢过程中的中间性产物，但不是主链上的产物，其生成机制很复杂，对菌种的要求很高，国内菌种的产酸水平为：3555g/L，转化率为：2025%，远低于国外的生产水平； （2）提取率较低； （3）生产规模较小。,二、赖氨酸生物合成途径,目前已知的赖氨酸生物合成途径有两条，一条以细菌类为主、另一条以酵母菌为主。由于酵母菌体内的赖氨酸的生物合成产率要低于细菌类的，因此，目前的赖氨酸发酵生产都是采用细菌为生产菌种。,细菌类发酵与酵母菌发酵的比较： 优点： （1）菌体体积较小，相

14、对增殖所用的底物较少，产率高。 （2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有十几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。 （3）细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。,缺点： 1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。 2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。 3）细

15、菌发酵易感染噬菌体。,大肠杆菌中的Lys的生物合成与代谢调控,大肠杆菌赖氨酸代谢特点： 关键酶：天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三个终产物分别是：Lys、Met和Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶的活性才能完全被抑制。 同功酶：天冬氨酸激酶1，天冬氨酸激酶2，天冬氨酸激酶3，三个酶催化同一反应，但其活性受不同代谢产物体调节的酶。,根据上述代谢特点，要使菌体合成并积累Lys，可以选育高丝氨酸脱氢酶缺陷型Hos-，这样的话，既可以解除天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向Lys的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；更重要的是由于Hos-，使得代谢过程中不可能产

16、生过量的Met、Thr，尽管产生了大量的Lys，Lys可以抑制关键酶天冬氨酸激酶3，但是天冬氨酸激酶1、2的活性由于Met、Thr的限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸半醛，仍可以大量的生成，这就保证了Lys的生物合成途径的畅通无阻。,三、赖氨酸生产菌的育种途径 首先，选择出发菌株。不同微生物的赖氨酸生物合成的调节机制不同，应该选择代谢调节机制比较简单的细菌作为出发菌株，如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌和乳糖发酵短杆菌等。 其次，根据菌株特性选育赖氨酸产生菌。方法有： 优先合成的转换选育渗漏缺陷型 选育高丝氨酸脱氢酶渗漏缺陷型， 此突变株的高丝氨酸脱氢酶活性仅为野生株的1/30，于是合成的苏氨酸

17、少，不足以与赖氨酸共同对天冬氨酸激酶活性产生协同反馈抑制作用，就可以过量积累赖氨酸。需要注意，活性很低的高丝氨酸脱氢酶容易受苏氨酸抑制和蛋氨酸阻遏，相应地造成苏氨酸或蛋氨酸缺乏，而抑制生长。,切断支路代谢选育营养缺陷型 诱变选育高丝氨酸缺陷型（高丝氨酸脱氢酶缺失），切断通向苏氨酸、蛋氨酸的代谢流，同时控制培养液中高丝氨酸（或苏氨酸蛋氨酸）量，降低苏氨酸浓度，解除赖氨酸苏氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制作用，从而过量积累赖氨酸。,选育抗结构类似物突变株 通过诱变使编码天冬氨酸激酶的结构基因发生突变，使天冬氨酸激酶对赖氨酸及其结构类似物（S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸，AEC）不敏感，即使在过量苏

18、氨酸存在时，该酶也不与赖氨酸或其结构类似物结合，但酶的活性中心不变。 这种突变株遗传性地解除了终产物对自身合成途径的酶的调节控制，不受培养基中所要求的物质浓度影响。 只有抗性的菌株其赖氨酸产量不高，而具有抗性兼有营养缺陷型的菌株，赖氨酸产量大为提高。,解除代谢互锁 在乳糖发酵短杆菌中，赖氨酸的生物合成与亮氨酸的生物合成之间存在代谢互锁。赖氨酸生物合成分支途径的第一个酶二氢吡啶二羧酸（DDP）合成酶的合成受亮氨酸阻遏，使丙酮酸通向赖氨酸的代谢受阻，而流向丙氨酸、缬氨酸。 解除这种代谢互锁的方法有：选育亮氨酸缺陷型菌株；选育抗亮氨酸结构类似物（2噻唑丙氨酸）突变株；选育对苯醌或喹啉衍生物敏感株（即

19、亮氨酸渗漏缺陷型菌株）。,增加前体物的合成和截断副产物生成： 增加天冬氨酸浓度，天冬氨酸激酶与底物的亲和力协同性增大，能够抵消变构抑制剂的影响，使前体物（丙酮酸、草酰乙酸、天冬氨酸等）充分地用于合成赖氨酸。增加前体物合成可采用的方法有：A.选育丙氨酸缺陷型；B.选育抗天冬氨酸结构类似物（天冬氨酸氧亏酸，ASPHX）突变株；C .选育适宜的CO2固定酶TCA循环酶活性比突变株。 改善细胞膜的透过机理,选育温度敏感突变株：如果突变位置发生在为亮氨酸合成酶系编码的基因中，使翻译出来的酶对温度敏感，则高温时就不能合成亮氨酸，即成为亮氨酸缺陷型，可解除代谢互锁。 有实用价值的赖氨酸高产菌株多为营养缺陷、

20、敏感性、结构类似物抗性等性状的双重、三重或多重标记的突变株。 应用细胞工程和遗传工程育种 把依靠诱变技术取得的优良特性通过重组DNA技术加以组合和应用。,防止高产菌株回复突变 防止菌株回复突变至关重要。其方法除了经常进行菌种纯化、检查遗传标记、减少传代次数、不用发酵液作为种子外，还可采用以下方法：A.选育遗传性稳定的菌株；B.定向赋加生产菌多个遗传标记。对抗性菌株，尽量育成多重抗性，增加抗回复突变，使生产性能稳定；C.菌种培养和保藏时，培养基要丰富，尤其有足够的要求营养物。对抗性菌株，应添加所耐的类似物；D.在培养突变株时添加抗生素（如红霉素、氯霉素），抑制恢复突变株生长，使其达到分离纯化的目

21、的。,第四节 芳香族氨基酸发酵机制,芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分子中都含有苯环结构，所以称作芳香族氨基酸。这三种氨基酸在结构上的另一个共同点，是其直链都是丙氨酸。,人体的酪氨酸是由苯丙氨酸转化而得。苯丙氨酸、色氨酸是必需氨基酸，用作氨基酸输液。因为色氨酸是玉米中所缺乏的氨基酸，故又用于饲料添加剂，另外，苯丙氨酸是二肽甜味剂的原料。,DAHP合成酶（DS）,分支酸变位酶（CM）,芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成的调节机制： 1、DAHP合成酶（DS）：有三种同功酶， DS1受苯丙氨酸反馈控制，DS2受色氨酸反馈控制， DS3受酪氨酸反馈控制。图5-21酶1。 2、分支酸

22、变位酶（CM）：有两种同功酶， CM1受苯丙氨酸反馈控制，CM2受酪氨酸反馈控制。图5-21酶13。,第四节 分枝氨基酸,分枝链氨基酸（异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸）：有甲基侧链。 图525分支链氨基酸的生物合成途径P94,第四节 精氨酸的发酵机制,精氨酸族氨基酸（鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸）：以谷氨酸为前体。,鸟氨酸,瓜氨酸,精氨酸是具有胍基的碱性氨基酸，它和组氨酸一起，称为半必需氨基酸，在幼小动物的营养上，有重要价值。瓜氨酸是西瓜和柿子中的游离氨基酸。鸟氨酸以肽的形式，存在于细菌中。在医药上，除作试剂和输液以外，通常，精氨酸和鸟氨酸一起，用作保肝、强身、解毒剂之类药剂的原料。瓜氨酸有利尿作用。,*天冬氨酸,精氨酸代琥珀酸,精氨酸的合成,精氨酸,氨基酸发酵机制小结,1、掌握谷氨酸的生物合成途径及调节机制。 2、了解赖氨酸的生物合成途径及调节机制。 3、了解芳香氨基酸、分支氨基酸及精氨酸的生物合成途径。,思考题,1、柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？ 2、简述二氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。 3、写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明CO2固定化反应的重要性。 4、谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的GA，其菌种内在的原因有哪些？ 5、谷氨酸发酵过程中，生物素（VH）作用表现在那几个方面？,