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1、医学微生物学实验,主讲：马玉龙 Tel:15903060813 Email:,新乡医学院微生物学教研室：3029130 科教科：3029945,注意！,本次实验部分涉及生物危险(粪便中致病微生物)，请谨慎操作(无菌操作)！,内 容 提 要,一 肠道杆菌的鉴定（2学时） 革兰染色（1片/人），双糖铁培养 基接种（8支/室），玻片凝集试验（1片/人） 二 药敏试验（0.5学时） 介绍及展示示教平板 三 抗酸染色（2.5学时） 示教，1片/人,一 肠道杆菌的鉴定（2学时）,病原菌的检验程序,概念：用生化的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢产物，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反应试
2、验。 意义：是鉴别细菌的重要依据。,1.细菌的生化反应,糖发酵试验,原理 根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。,1、确定细菌是否生长 2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”表示。 3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用“ ”表示。 4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”表示。,结果,方法,取糖发酵管培养基，此时培
3、养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，接种细菌后置37温箱培养1824小时，观察结果。,硫化氢产生试验,原理 某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸、甲硫氨酸，而生成硫化氢。硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化亚铁沉淀物。 方法 分别穿刺接种大肠杆菌、伤寒杆菌至两管双糖铁培养基中。37孵育24小时后观察结果。,结果,沿穿刺线部位呈黑褐色， 表明有硫化氢产生，为阳性以“+”表示， 不变色者为阴性，以“-”表示。 大肠杆菌：- 伤寒杆菌：+,2.肠道杆菌的鉴定,实验目的： 熟悉病原性杆菌的一般鉴定过程,粪 便增菌培养（必要时） SS 培养基 双糖铁培养基 生化反应 血清学鉴
4、定,肠道杆菌的鉴定程序,已完成,革兰染色,大肠杆菌在SS平板上的菌落特点； 伤寒杆菌在SS平板上的菌落特点；,（1）观察SS平板上菌落特点,SS平板 大肠杆菌 粉红色大菌落 痢疾杆菌 无色细小 半透明菌落 伤寒杆菌 无色细小 半透明菌落,（2） 双糖铁培养基接种,双糖铁培养基成分 含有乳糖和葡萄糖：产酸产气 含有硫酸亚铁：如细菌分解含硫氨基酸生成 硫化氢，可形成黑色沉淀 酚红指示剂： 酸：黄 碱：红,各菌的生长特点 1)大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气（糖发酵试验），是斜面及底层均呈黄色并有气泡。 2) 沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖，不发酵乳糖，分解葡萄糖产的酸使培养基pH下降，酚红指示剂变黄，
5、但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%，在斜面的酸性物质被氧化成挥发性酸，且细菌氧化氨基酸物质产生的氨的中和作用，使斜面变红，而底层则为黄色。,双糖铁培养基接种方法,将可疑菌落接种于双糖铁培养基上（穿刺+斜面 ），37度培养24小时，第二天观察结果。,双糖铁培养基上各菌的生长现象,冲洗,染色完成之后，在涂片区滴上香柏油使用油镜观察实验结果,（3）革兰染色方法与步骤 1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色 初染（结晶紫） 媒染（卢戈氏碘液） 脱色 （95%乙醇） 复染（稀释石碳酸复红） 吸水纸 吸干,1min,1min,30s,30s,冲洗,冲洗,冲洗,（4）伤寒杆菌玻片凝集试验,原理： 当颗
6、粒性抗原与其相应的抗体特异结合时，在电解质存在下，两者比例合适时，可出现凝集颗粒，此现象称凝集反应。,试剂与器材 沙门氏菌属AE群多价O血清， SS平板上菌落， 玻片、消毒缸、酒精灯，记号笔等。 方法 1.取清洁玻片一张，用记号笔划分成两部分。用移液枪分别在两边加沙门氏菌属A-E群多价O血清8微升。 2.无菌操作下用接种环分别取少许SS平板上菌落（黑色或无色菌落，以及粉红色大菌落）与血清混合成均匀乳状(注意：取菌量不宜过多，使悬液呈轻度乳浊即可)。 3.轻轻摇动玻片，经1-2min后观察结果。,注意事项： 注意涂菌时，标明菌落，以免混淆产生错误结果。 记录结果之后，将玻片放入含消毒液的指定容器
7、内，切勿任意放置或冲洗。,结果观察 液体变清，并有乳白色凝集块出现者为阳性。 液体仍然混浊，无凝集块出现者为阴性。 如待检菌与沙门氏菌属A-E群多价O血清发生凝集，则该菌为沙门氏菌属。,（5）结果判断,SS平板：菌落的形态，颜色； 双糖铁培养基上生化特点； 革兰染色：形态，排列，染色特点； 玻片凝集试验结果,本次实验所做内容,杆菌鉴定 观察菌落特征（SS平板） 取可疑菌落做革兰染色 4片/台 将可疑菌落接种于双糖铁培养基上（穿刺+斜面 ），37度 培养24小时，观察结果. 1支/台 伤寒杆菌玻片凝集试验,二 药敏试验（0.5学时）,目的要求,1.掌握纸片扩散法药敏试验的原理及结果判定 2.了解
8、药敏试验的操作方法和意义,原理,含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。,主要材料,1.大肠杆菌菌液普通琼脂平板 2.含抗生素的滤纸片： 青霉素 氯霉素 链霉素 庆大霉素,方法,标记分区 密涂接种 贴片 培养 结果观察,1.标记分区,底部观,2.密涂接种,分三次接种，每次取一环。第一次密涂接种后旋转60度二次密涂接种，然后同方向旋转60度后再次密涂接种。,顶部观,3.贴片,底部观,4.培养,置
9、37温箱， 倒置培养18h-24h,青霉素,链霉素,庆大霉素,氯霉素,五、 结果 抑菌圈,抑菌圈直径,结果观察,抑菌圈直径15mm 高度敏感 抑菌圈直径10-15mm 中度敏感 抑菌圈直径10mm 低度敏感 无抑菌圈 不敏感或耐药,注意事项,接种时均匀密涂 贴片时，用无菌镊子轻轻触压药物纸片使之与培养基充分接触 贴片后不能再更改纸片位置 镊取药物纸片时一旦掉到培养基表面，则继续保持其位置，切勿镊起重新放置，以防不同抗生素交叉影响 整个贴片过程应在15min内完成,一、实验目的： 1、掌握细菌涂片标本的制备 2、掌握抗酸染色的原理和方法,三 抗酸染色,分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝
10、菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。,二、实验原理：,三、实验材料： 细菌：卡介苗 （Bacillus Calmette-Guerin， BCG） 染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美兰溶液 其它：接种环、酒精灯、载玻片等,四、实验方法： 1、细菌涂片标本的制备 涂片 干燥 固定 2、染 色,
11、1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。 2）脱色： 3%盐酸酒精脱色301；用水冲洗。 3）复染：用碱性美兰溶液复染1；用水冲洗后用吸水纸吸干。,3、油镜观察,未染色 初染后 脱色后 复染后,初染,脱色,复染,镜检,五、实验结果：,结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。,六、注意事项：,1、无菌操作 2、涂片厚度要适中 3、固定 4、冲洗 5、染色时间 6、初染加热的温度，勿沸腾,实验报告,1. 肠道致病菌的分离，培养和鉴定 2.抗酸染色 一、目的 二、原理 三、材料 四、方法 五、结果（图） 六、意义 七、注意事项,下周实验内容,1.病毒的接种（小鼠和鸡胚） 2.真菌菌落的形态观察 3.考试,