微生物实验内容汇总.ppt

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1、医学微生物学实验,微生物学教研室,第一次 实验内容,细菌基本形态观察 （球菌、杆菌、螺形菌） 细菌特殊结构观察 （荚膜、鞭毛、芽胞） 革兰染色法,1.细菌的三种基本形态,球菌：葡萄球菌。 杆菌：大肠杆菌。 螺形菌：霍乱弧菌。,细菌的三种基本形态示意图,葡萄球菌：,Figure 1 - A Gram stain of Gram + Staphylococcus cells.,显微镜下的杆菌,杆菌(bacillus),Figure 2 - Gram stain of Gram - E. coli cells,弧菌,霍乱弧菌,Figure 3 - Gram stain of Gram Cholera

2、 cells,2.细菌的特殊结构观察,芽胞示教片：破伤风杆菌。 鞭毛示教片：变形杆菌。 荚膜示教片：肺炎双球菌。,芽孢,产芽孢细菌的种类,菌体 （营养细胞）,芽胞,破伤风梭菌1000,鞭毛,变形杆菌鞭毛1000,荚膜的观察：,负染色,【菌种】 齿垢 【试剂】 生理盐水、结晶紫、碘液、95%乙醇、复红 【材料】 酒精灯、接种环、玻片、,3.革兰氏染色法,由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。,【操作步骤】,1 min,1 min,30 s,1 min,滤纸吸干，油镜观察,结晶紫 1 碘液 1 95% 乙醇 30” 复红 1 冲洗 滤纸干燥 油镜观察,冲洗,冲洗,冲洗,

3、染色,初染,媒染,脱色,复染,紫色（G）,革兰氏染色步骤示意图,革兰氏染色,甲菌,乙菌,初染,结晶紫,媒染,碘液,脱色,乙醇,复染,复红,紫色（G）,红色（G-）,革兰氏染色步骤示意图,【结果】,细菌被染成紫色者，称为革兰氏阳性菌； 而细菌染成红色者，称为革兰氏阴性菌；,阳性菌紫色 阴性菌红色,【意义】,鉴别细菌，用本法染色可将细菌分成两大类。 了解致病性 指导选择用药,【革兰氏染色法的原理 】,革兰氏染色法的原理尚未阐明，可能与以下因素有关。 1、通透性学说 2、等电点学说 3、化学学说,通透性学说,G+菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易进入。 G-菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层

4、薄，含大量脂质，乙醇易渗入。,等电点学说,G+菌等电点（pI23） G-菌等电点（pI45） 在相同pH条件下G+菌所带负电荷比G-菌多，所以与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。,化学学说,G+菌菌体内含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫等染料牢固结合，使已着色的细菌不易被乙醇脱色 G-菌 菌体内含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色,注 意 事 项,涂片的厚度。 固定的程度。 染色的时间控制：一一半一。 冲洗的方法，不要对着涂片区。 95% 乙醇脱色时间。,第二次 实验内容,一、细菌基础培养基的制备（示教） 二、细菌分离接种技术（操作） 平板划线接种法；斜面培养基接种法 液体培养基接种法；半

5、固体穿刺接种法 三、细菌在培养基上生长现象（观察）,一、细菌基础培养基制作,液体培养基制作 普通肉汤培养基成分： 新鲜牛肉浸液100ml，蛋白胨1g，NaCl 0.5g 称量，包装，灭菌后使用。 固体培养基制作 称取营养琼脂4.5g，加入100ml蒸馏水中溶解。 包装后灭菌使用。 斜面培养基制作,1、称量及溶化,2、调pH,3、加琼脂、溶化、定容、（过滤）,4、分装、加塞、包扎,5、灭菌,（6、摆斜面）,操作步骤,1. 半固体培养基接种法（操作） 2. 斜面培养基接种法 3. 液体培养基接种法,细菌的分离接种接技术,（一）分离培养,1. 平板分离划线接种法（操作）,（二）纯培养,平板分离划线接

6、种法,连续划线法 分段划线法,Rotate 90,Flame loop,Rotate 90,Flame loop,平板划线接种法（分离培养法）,培养结果,1,3,2,注意事项：,1.各区之间接种环要灭菌,2.用力适当，不要划破 琼脂表面,3.注意无菌操作,斜面培养基接种法（操作）,用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。,液体培养基接种法,半固体培养基接种法（操作）,方法：穿刺接种,结果：沿穿刺线生长动力- 扩散生长动力+,三、细菌在培养基上生长现象,沉淀成链生长 浑浊均匀分散生长 菌膜表面生长（需氧菌）,1. 固体,2. 半固体,3. 液体,菌落 菌苔,动力+ 动力-,固体培养基生长现象,

7、液体培养基中生长现象,沉淀生长,混浊生长,表面生长,半固体培养基中生长现象,有鞭毛 动力+,无鞭毛 动力,沿刺线生长,混浊生长,细菌在培养基上生长现象,第三次 实验内容,一、细菌分布实验 空气中细菌的检查 皮肤、日常物品细菌的检查 二、药敏实验,一、细菌的分布实验,（1）空气细菌检查 材料：培养基，普通琼脂平皿 （2）皮肤（其他物品）消毒前后的细菌检查 材料：培养基，无菌生理盐水，75%酒精棉球， 2.5%碘酒棉球，无菌棉棒 （3）自来水中的细菌检查 材料：培养基，无菌棉棒，酒精灯,1. 空气中细菌的检查,取三块琼脂平板，将2个打开皿盖 分别置于不同的环境1530min后， 盖好皿盖。另外1个

8、不启盖作为对 照。置37培养1824h。,材料：,普通琼脂平板,方法：,结果：,计数菌落数，观察菌落数的差异。,2、皮肤消毒前后的细菌检查方法,在1个平皿底部做好标记，分为消毒前与消毒后两个区域。 取一支无菌棉签放入无菌盐水中浸泡，在管壁上挤干水后擦拭皮肤或其他物品，然后将该棉签涂布于无菌平皿消毒前区域，作来回划线，注意勿划破琼脂表面。 将皮肤区域或物品用碘酒棉球及酒精棉球涂擦消毒，另取一支无菌棉棒用消毒前所述方法取材，接种于标有消毒后的平皿区域。 平皿37、24h培养后取出观察表面有无细菌生长，比较消毒前后菌落数目，描述菌落特征。,结果：,计数菌落数,371824h,消毒前,消毒后,自来水中

9、的细菌检查,在1个平皿底部做好标记。 用酒精灯对水管口灭菌，拧开水管开关放水15S。 取一支无菌棉签蘸取自来水，将该棉签涂布于标有消毒前的无菌琼脂平皿表面，作来回划线，注意勿划破琼脂表面。 将平皿于37、24h培养后取出观察平皿表面有无细菌生长，描述菌落特征。,二、药敏试验（纸片扩散法）,材料：,方法：,普通琼脂平板(2块平板/组） 大肠杆菌、金葡菌 氯霉素、青霉素、碘酒、结晶紫,G+,G-,步骤（无菌操作） 1、在培养基平皿上做标记。 2、接种；用棉签分别沾取菌液（G+，G-）均匀分别涂布于2个平皿上。 3、贴药片；镊子灭菌取药片放置于平皿上的标记 位置，再灭菌后可取另一药片放置。 4、37

10、，过夜培养，观察结果。,药敏实验（纸片扩散法）,药敏实验结果,药敏实验结果,第四次 实验内容,病原性球菌标本片观察 链球菌、 脑膜炎双球菌 血浆凝固酶试验 抗“O”试验,目的要求,掌握病原性球菌的基本形态。 掌握药敏实验操作技术与判断。,链球菌,脑膜炎双球菌,原理和意义 致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使人或动物血浆发生凝固，因此，测定血浆凝固酶的有无是鉴定葡萄球菌致病性的重要依据。,血浆凝固酶试验,步骤：,血浆 血浆,1,2,金葡 白葡,+ +,凝集（+）,不凝集（-）,血浆凝固酶试验,生理盐水,+ +,无菌操作：,血浆凝集试验结果,链球菌侵入体内产生SLO，刺激机体产生相应抗体ASO，当两

11、者中和后，再加入SLO 乳胶试剂，因病人血清中ASO量很多，未被中和掉的抗体与乳胶试剂反应，产生清晰凝集，为阳性；无凝集，为阴性。 方法：间接凝集 结果：效价大于400单位 意义：风湿热及其活动性的辅助诊断,抗“O”试验（ASO test）,原理：,步骤：,抗“O”试验（ASO test）,阴性对照（1滴） 待检血清 （1滴） + + 胶乳试剂（1滴） 胶乳试剂（1滴）,- ？,2min,2min,第五次 实验内容,操作：肥达试验 肉毒梭菌、产气荚膜菌标本,肥达实验,肥达试验（Widal test）是用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原与病人血清做定量凝集试验，以测定患者血清中

12、有无相应抗体，根据抗体含量的多少以及增长情况，可帮助诊断伤寒及副伤寒。,【原理】,肥达反应稀释法示意表,肥达实验结果判断,血清的凝集效价（滴度）：是指能与一定量的抗原发生肉眼可见的明显凝集（即“+”凝集）的血清最高稀释倍数。血清效价代表血清中抗体的含量，血清效价越高，所含抗体的量愈多。,结果判断,1、正常凝集效价 伤寒沙门菌“O”抗体凝集效价在1：80以下，伤寒沙门菌“H”抗体在1：160以下， 甲、乙型副伤寒沙门菌“H”抗体凝集效价在1：80以下。 2、病程中动态观察 二份血清，第二次效价增长四倍以上有意义 3、O与H抗体在诊断上的意义,伤寒及副伤寒感染早期/交叉反应,伤寒及副伤寒感染晚期/

13、预防接种/非特异性回忆反应,伤寒,甲型副伤寒,乙型副伤寒,接种伤寒及副伤寒三联疫苗,非肠热症/早期用抗生素/免疫功能低下,3、O与H抗体在诊断上的意义,肉毒梭菌,产气荚膜梭菌,第六次 实验内容,一、细菌染色标本检查法 抗酸染色法（操作） 二、标本片观察： （钩端螺旋体 、白色念珠菌，曲霉、枯草杆菌）,分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理

14、也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。,一、抗酸染色原理,抗酸染色,材料： 标本：卡介苗 染液：石炭酸复红，3%盐酸酒精，美蓝 器具：同革兰氏染色,实验方法： 1、细菌涂片标本的制备 涂片 干燥 固定,3、油镜观察,1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。 2）脱色： 3%盐酸酒精脱色301；用水冲洗。 3）复染：用碱性美兰溶液复染1，用水冲洗后用吸水纸吸干。,2、染色,抗酸染色步骤,1、涂片包括涂片、干燥、

15、固定三步。 涂片 干燥 固定,抗酸染色步骤,2、染色包括初染、脱色、复染三步。,石炭酸复红维持 3-5 3%盐酸酒精30 1 美蓝复染1 冲洗 干燥 油镜观察,冲洗,冲洗,初染,脱色,复染,三、抗酸染色结果,抗酸菌呈红色， 常堆积成团， 排列无序， 偶呈分枝状生长。 背景及非抗酸性细菌呈兰色。,注意事项：,1、无菌操作 2、菌种管摇匀后取菌 3、涂片均匀 4、初染加热维持35分钟，勿沸腾烧干 5、冷却后冲洗 6、油镜下从视野中找红色抗酸菌,二、标本片观察,白色念珠菌 钩端螺旋体 枯草杆菌 曲霉,白色念珠菌,钩端螺旋体,类炭疽（枯草杆菌）,炭疽杆菌,曲霉,第七次 实验内容,脓汁标本中金黄色葡萄球

16、菌的鉴定,实验器材,标本：脓拭子、感染分泌物或模拟脓汁标本 菌种：金黄色葡萄球菌培养物、表皮葡萄球菌 培养基：血琼脂平板、甘露醇发酵管 其他：血浆、生理盐水、革兰染液、玻片、滴管 培养箱、 酒精灯、接种环等,检查原则,在脓汁标本中，以化脓性球菌最为常见，本实 验主要检测金黄色葡萄球菌 用药前采集标本 无菌操作,标本检测程序,脓汁、脓性分泌物（未知菌液/固体培养物）,涂 片 革兰染色 镜 检,血琼脂平板,接种,直接,菌落观察,血浆凝固酶试验,甘露醇发酵,诊断报告,检查方法和结果报告,直接显微镜检查：取标本直接涂片，均匀涂成菌膜，自然干燥，固定后革兰染色，油镜观察。 注：若染色后未发现细菌，可报告

17、“直接镜检未发现细菌”,检查方法和结果报告,细菌分离培养：取脓液或创伤分泌物接种于血琼脂平板上（接种后4保存），划线分离，37培养1824h后，观察菌落特征，取单个菌落进行革兰染色镜检。 注：第2天观察记录结果；如培养4872h后仍然无菌生长，则报告“无细菌生长”。,检查方法和结果报告,血浆凝固酶试验（玻片法）： 用灭菌接种环取标本和白葡菌（阴性对照）培养物少许，分别与玻片左右二侧的生理盐水制成均匀菌悬 于玻片玻片左右二侧菌悬液中各加血浆一滴并轻轻摇匀 13分钟内观察结果，出现颗粒状凝集为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性,结果报告：,检查方法和结果报告,甘露醇发酵试验：无菌操作取标本和白葡菌（阴性对照）培养物分别接种于甘露醇发酵管，其上覆盖无菌液体石蜡油，37培养1824小时，观察结果。金葡菌发酵甘露醇产酸，使培养基变混充，颜色由紫色变黄色，是为甘露醇发酵试验阳性，而白葡菌相反。 注：第2天观察记录结果,