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1、微生物工程,利用生物特性和发酵理论，通过现代化的工程技术手段，进行工业化规模生产，使受培养的微生物或动植物细胞积累所需产品的一门技术学科,微生物发酵技术,1857年法国化学家、微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。” 巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。 同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。,利用微生物的特点,发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌 利用微生
2、物的特点： (1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力 (2)有极强的消化能力 (3)有极强的繁殖能力,一、发酵的定义,1、传统发酵 2、生化和生理学意义的发酵 3、工业上的发酵,1、传统发酵,最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。,2、生化和生理学意义的发酵,指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。 如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。,图示总结,E1,E2,葡萄糖,ATP,ADP,葡萄糖-6-磷酸,果糖-6-磷酸,ATP,ADP
3、,1，6-二磷酸果糖,乳酸,NAD+,NADH+H+,E3,E1：己糖激酶 E2：6-磷酸果糖激酶-1 E3：丙酮酸激酶,3-磷酸甘油酸,2-磷酸甘油酸,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,ATP,ADP,1，3-二磷酸甘油酸,磷酸二羟丙酮,3-磷酸甘油醛,NAD+,NADH+H+,ADP,ATP,Pi,H2O,3、工业上的发酵,泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程 包括： 1. 厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。 2. 通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。 产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。,二、发酵工业,1.定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加
4、工，获得产品的工业。,适宜的微生物 保证或控制微生物进行代谢的各种条件 进行微生物发酵的设备 精制成产品的方法的设备,2.获得发酵产品的条件,三、发酵工业的发展历史,天然发酵阶段 纯培养技术的建立：巴斯德，科赫等。人为地控制微生物的发酵进程。 通气搅拌发酵技术的建立： 青霉素的生产深层培养 代谢控制发酵技术：微生物进行甾体化合物的转化，Glu和Lys发酵生产。对微生物具有高度专一性的酶反应作为合成手段的一部分加以利用，进行合理的代谢。,开拓发酵原料时期： 石油发酵，醋酸生产谷氨酸 基因工程阶段： 采用酶学的方法，将不同来源的DNA进行体外重组，再把重组DNA设法转入受体细胞内，并进行繁殖和遗传
5、下去。人们能够根据自己的意愿将微生物以外的基因件导入微生物细胞中，从而达到定向地改变生物性状与功能创新的物种，使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物。,四、发酵工业的范围,1、以微生物细胞为产物的发酵工业 2、以微生物代谢产物为产品的发酵工业 3、以微生物酶为产品的发酵工业 4、生物转化或修饰化合物的发酵工业 5、微生物废水处理和其他,1、生产微生物细胞物质,定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。 特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段
6、，生长稳定期产量最高。,2、微生物酶发酵,酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。 分类：胞内酶 和胞外酶 生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。,3、微生物代谢产物发酵,包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。 对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。 各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。,4、微生物的生物转化,定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经
7、济价值的化合物。 最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。,5、微生物特殊机能的利用,利用微生物消除环境污染 利用微生物发酵保持生态平衡 微生物湿法冶金 利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。,五、发酵工业的特征,发酵过程中离不开微生物的作用 1、发酵原料的选择及预处理 2、微生物菌种的选育及扩大培养 3、发酵设备选择及工艺条件控制：常温、常压。种子扩大培养和发酵采用不同的工艺。 4、发酵产物的分离提取 5、发酵废物的回收和利用,(1)发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行
8、生物资源的改造和更新。 (2)微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种选育，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。,(3)发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件简单。 (4)发酵对杂菌的污染的防治至关重要。反应必需在无菌条件下进行。 (5)由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。,(6)发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单一的代谢产物。 (7) 工业发酵与
9、其他工业相比，投资少，见效快，并可以取得较显著的经济效益。 (8) 除利用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的遗传工程菌进行反应。,六、发酵方法的类别与流程,1、类别： 根据对氧的需要区分： 厌氧和有氧发酵 根据培养基物理性状区分： 液体和固体发酵 根据从微生物生长特性区分： 分批发酵和连续发酵,2、发酵的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,2. 工业发酵步骤和工艺流程,(1) 用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制 (2) 培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌 (3) 将已培养好
10、的有活性的纯菌株以一定量转接到发 酵罐中 (4) 将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物 (5) 将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品 (6) 回收或处理发酵过程中产生的废物和废水,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐中试,由实验室研究到产业化的过程,发酵生产,发酵工程生产产品的流程图,The essential components of a fermentor,发酵的主体设备,2.1发酵原料的预处理,原料不同处理方法也有所差异。 1. 淀粉利用前需变成糊精或葡萄糖 方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法 2. 糖蜜加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐 3. 碳氢化合物：石
11、油脱蜡一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10的油，加入适量无机盐进行接种发酵,2.2菌种斜面培养,菌种：已有的优良生产菌种和选育的新菌种 方法：一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。,2.3 种子扩大培养,扩大培养的方法可以根据需要采用固体培养或液体培养两级不同方式。 固体种子扩大培养一般采用传统的制曲工艺，一般先用克氏瓶或匣子瓶进行扩大，再转接到曲盘扩大培养。 需氧微生物：将克氏瓶表面培养的菌种接到装有液体培养基的三角瓶中，在摇床上振荡培养。 厌氧微生物：将有菌种的试管斜面或克氏瓶转接到三角瓶液体培养基
12、中静置培养。,2.4 微生物发酵和控制,发酵方式可分为固体发酵和液体发酵两种。 固体发酵：适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品。 液体深层发酵：适合于大规模工业化生产。 影响发酵的因素很多，如温度、pH、通风、搅拌、罐压力等等，必须适当地控制影响发酵的各种条件，掌握发酵的动态，并进行杂菌的检查和产物测定，使整个发酵过程顺利进行。,2.5 发酵产物的分离提取,利用菌体：离心沉淀或板框压滤法使菌体与醪液分开，也可以用喷雾干燥法直接做成粉剂。 酒精发酵醪蒸馏塔蒸馏； 抗菌素及有机酸根据产物的不同特性，采用离子交换树脂吸附处理、脱色过滤、减压浓缩等方法提取精制。 获得的产物都要按照有关部
13、门制定的国家标准进行质量检验和性能测定，符合要求后才为合格产品。,常见的工业微生物,微生物是个体微小的生物的总称， 包括原核类（细菌） 真核类（真菌、原生动物、单细胞藻类） 非细胞类（病毒）。,菌种的来源,微生物的类群庞杂,原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒,目前已经知道的微生物约有10万种，分布在以下各界中：,农田上层15cm处微生物的数量,菌落数与空气清洁度的关系,人体微生态中微生物的含量,人体消化系统中微生物群体 (个/g),一、细菌,1、细菌的结构,一、细菌,2、细菌的繁殖：,细菌主要是以二分裂的方式进行繁
14、殖,一、细菌,3、细菌的菌落 定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做群落。 特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。 功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落，可以作为菌种鉴定的重要依据。 举例：如啤酒酵母菌落、红酵母菌落等。,几种菌落,二、放线菌,1、放线菌的形态,二、放线菌,2、放线菌的结构,培养基,二、放线菌,3、放线菌的分布 放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。 4、放线菌的繁殖 放线菌没有有性繁殖，主要通过形成无性抱子形式进行无性繁殖，成熟的分生孢子或孢囊孢子在
15、适宜环境里发芽形成新的菌丝体。,三、病毒,1、病毒的形态,三、病毒,2、病毒的繁殖,吸附,微生物工业对菌种的要求,培养基原料来源广、廉价； 培养条件易控制； 发酵周期短； 菌株高产； 抗病毒（噬菌体）能力强； 菌株性状稳定，不易变异退化； 菌体本身不能是病原菌；,真菌（青霉素、头孢等）,一、抗生素生产有关的微生物,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,菌种的来源,已工业化产品生产菌的介绍,二、氨基酸生产有关的微生物,代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用
16、。,50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,葡萄糖-磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸-丙氨酸.亮氨酸等,乙酰辅酶A,草酰乙酸,PS:2,3-二氢吡啶二羧酸合成酶,三、食品酶制剂生产有关的微生物,开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌,生产菌种的保藏与选育,菌种保藏 （1）目的：
17、 存活，不丢失，不污染； 防止优良性状丢失； 随时为生产、科研提供优良菌种。 （2）基本原理：根据菌种的生理生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。 （3）常用的菌种保藏方法：斜面低温保藏法、石蜡油封保藏法、砂土保藏法、硅胶保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法等。,几种常用菌种保藏方法的比较,菌种选育,（1）目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用等。 （2）方法：A、自然选育；B、生产选育；C、抗噬菌体菌株选育；D、诱变育种；E、代谢控制育种；F、基因重组育种；,一、菌种分离的一般过程,土样的采取, 预处理, 培养, 菌落的选择,
18、菌种的鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,自然界中有目的微生物分离的原则,菌种保藏,从自然界分离的菌种,二、采样时要注意的问题,气候、水分、空气,来源要广,结合产品的特点,标签：地点、时间、气候等,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。,三、目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的：,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法,定向培养的富集方
19、法,1、底物,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。,四、菌落的选出,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选,采样（造纸厂）,80度30分钟处理,文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌,0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养34天，选择
20、有凹陷圈的菌落,目的,提高生产能力,提高产品质量,开发新产品,解决生产实际问题,防止菌种退化,菌株选育、分子改造,方法,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组：,杂交、原生质体融合、基因工程,基因的直接进化：,点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等,菌株选育、分子改造,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9,自然突变有两种情况：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。,一、自然选育,菌株选育、分子改造,自然选育在工业生产上的意义,自然选育虽然突变率
21、很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。,回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变,问题：,高产菌株是正突变高，还是负突变高？,菌株选育、分子改造,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落(注意形态的观察),发酵试验,菌株选育、分子改造,诱变育种,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,.常用诱变剂的使用方法,物理诱变剂：紫外辐射、电离辐射 化学诱变剂： 碱基类似物：5-溴尿密啶-碱基错配 羟
22、化剂羟胺-C变成N-4-羟基胞嘧啶(只能与A配对) 脱氨剂：亚硝酸-是A、G、C脱落或DNA交联 烷化剂：亚硝基胍、甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯-碱基错配或脱落,紫外线,这是一种使用方便、诱变效果很好的常用诱变剂。在诱变处理前，先开紫外灯预热20分钟，使光波稳定。然后，将35ml细胞悬浮液置6cm培养皿中，置于诱变箱内的电磁搅拌器上，照射35分钟进行表面杀菌。打开培养皿盖，开启电磁搅拌器，边照射边搅拌。处理一定时间后，在红光灯下，吸取一定量菌液经稀释后，取0.2ml涂平板，或经暗培养一段时间后再涂平板。,5-溴尿嘧啶(5BU),称取5-BU，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为2mg/ml。将细胞培
23、养至对数期并重悬浮于缓冲液或生理盐水中过夜，使其尽量消耗自身营养物质。将5BU加入培养基内，使其终浓度一般为1020g/ml，混匀后倒平板，涂布菌液，使其在生长过程中诱变，然后挑单菌落进行测定。,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV,营养缺陷型：如Thr缺陷型,菌株选育、分子改造,抗性突变型 筛选各种抗性突变型也是生产上常用来提高某些代谢产物的重要途径。如：解烃棒状菌(C .h ydrocarbaclastus)可以产生棒杆菌素(Carynecin)，它是氯霉素的类似物。抗
24、氯霉素的解烃棒杆菌突变株能产生4倍于亲株的棒杆菌素。枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的-淀粉酶的产量较亲本提高了5倍,代谢工程育种,代谢工程，又称代谢途径工程或途径工程，是利用基因工程技术改造细胞的代谢，以改善细胞的性能的一门新兴学科 。 代谢工程可以在对细胞的整个代谢网络的代谢流进行定性、定量分析的基础上，找出制约目标产物积累的关键酶催化反应，并利用基因重组技术直接对代谢途径中的关键酶进行修饰,基因工程育种,DNA重排-创造新基因-插入载体-转移宿主细胞表达-不同性状的重组菌株筛选,培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖 所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生 物培养提供除营
25、养外的其它所必须的条件。,发酵培养基,发酵培养基的作用：,满足菌体的生长 促进产物的形成,发酵培养基的要求, 培养基能够满足产物最经济的合成。 发酵后所形成的副产物尽可能的少。 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源 丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的 供应。 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。,培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型,一、按纯度,合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定,适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律,培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业 生产,天然培养基: 采用天然
26、原料,原料来源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业 化生产,原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性,发酵培养基,培养基的类型及功能,M培养基(1L)： Na2HPO4 6g，KH2PO4 3g， NaCl 0.5g， NH4Cl 1g， MgSO4.7H2O 0.5g， CaCl2 0.011g，葡萄糖 2-10, pH 7.0,YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g, NaCl 10g，PH 7.2,培养大肠杆菌常用两种培养基,发酵培养基,二、按状态,固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产
27、,半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%0.8% ,主要用于微生物的鉴定。,液体培养基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。,三、按用途（从发酵生产应用考虑） 培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种,一、碳源,1、作用,提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分,提供合成目的产物所必须的碳成分,2、来源,糖类、油脂、有机酸、正烷烃,发酵培养基的成分及来源,3、工业上常用的糖类, 葡萄糖,所有的微生物都能利用葡萄糖 但是会引起葡萄糖效应,工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须
28、达到一定的质 量指标,不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大,发酵培养基的成分及来源, 淀粉、糊精,使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类,缺点：难利用、 发酵液比较稠、一般2.0%时加入一定的-淀粉酶 成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。,优点：来源广泛、价格底 难利用，可以解除葡萄糖效应,例：地衣牙孢杆菌生产-淀粉酶,碳源对生长和产酶的影响,碳源 细胞量 -淀粉酶 葡萄糖 4.2 0 蔗糖 4.02 0 糊精 3.06 38.2 淀粉 3.09 40.2,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,李江华，无锡轻工大学学报，2004,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,二、氮源,氮源主要
29、用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。,1、无机氮源,种类：氨盐、硝酸盐和氨水,特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH,无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调
30、节发酵过程的pH有积极作用。,所以选择合适的无机氮源有两层意义： 满足菌体生长 稳定和调节发酵过程中的pH,毛霉产蛋白酶的研究,初始pH的影响:,pH偏酸比较好，中性蛋白酶影响大,无机氮源的影响：,硫酸铵硝酸铵硝酸钠尿素,2、有机氮源,来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼 粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋 白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒 糟。,成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机 盐及生长因子。,例 玉米浆： 可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 较多的乳酸 硫、磷、微量元素等,发酵培养基,发酵培养基的成分及来源,有机氮源成分复杂
31、可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响,发酵培养基的成分及来源,氮源使用的一些相关问题：,有机氮源和无机氮源应当混合使用,早期：容易利用易同化的氮源无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质,有些产物会受氮源的诱导和阻遏,有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力,开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣 的课题,三、无机盐和微量元素,1、作用：各种不一样,2、来源：C、N源，以盐的形式补充,3、用量：根据具体的产品，以实验决定,4、使用注意点,A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无
32、机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑,发酵培养基的成分及来源,例：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20g/ml 发酵罐必须进行表面处理,B、使用时注意盐的形式（pH的变化）,例：黑曲酶NRRL-330,生产-淀粉酶，P对酶活的影响 pH 酶活 不加 4.25 120分钟 加 K2HPO4 5.45 30分钟 加 KH2PO4 4.62 75分钟,发酵培养基的成分及来源,四、生长因子、前体和产物促进剂,从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。,1、生长因子,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,
33、生长因子对发酵的调控起到重要的作用 。,有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子,前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。,2、前体,青霉素：分子量356,苯乙酸:分子量136,作用：前体有助于提高产量和组份,用量：前体的用量可以按分子量衡算，具体使用有个转化 率的问题,例：6000单位/ml的青霉素G,需要多少苯乙酸 青霉素6000*0.6（微克）36mg/ml 苯乙酸（36*136）/356=13.8m
34、g/ml=1.38% 实际使用时的转化率在46-90%之间 例某厂单耗为：0.337（kg/10亿青霉素） 转化率为：13.8/(0.337/0.6)*36=68%,用法：前体使用时普遍采用流加的方法 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化. 流加也有利于提高前提的转化率,3、产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。 有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改
35、善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产， 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,五、水,对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的，因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢影响甚大。,水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。,对于酿造行业，水的重要性不言而喻,对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清洁的水。,目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所
36、用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,发酵培养基的设计和优化,一、培养基成分选择的原则,菌种的同化能力,代谢的阻遏和诱导,合适的C、N比1000.22.0,pH的要求,发酵培养基的设计和优化,（一）、理论转化率与实际转化率,理论转化率是指理想状态下根据微生物的代谢途径进行物料衡算，所得出的转化率的大小。,实际转化率是指实际发酵过程中转化率的大小,如何使实际转化率接近于理论转化是发酵控制的一个目标,二、成分含量的确定,发酵培养基的设计和优化,例: 如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精的理论转化率计算如下 葡萄糖转化为酒精的代谢总反应衡
37、算式为 C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 葡萄糖转化为酒精的理论得率为 2*46 Y = = 0.57 162,发酵培养基的设计和优化,（二）、实验设计,培养基成分的含量最终都是通过实验获得的,合理的实验方法,多因子实验：均匀设计、 正交实验设计、 响应面分析等。,多因子实验, 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适 的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采 用一些合理的实验设计方法。,三、培养基设计的步骤, 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑 的问题，初步确定可能的培养基成分；, 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；,例：类胡萝卜素高产菌Y11的培
38、养基的优化,类胡萝卜素的作用：色素、营养保健,原培养基:,初步确定可能的培养基成分(以碳源为例),通过单因子实验确定适宜的培养基成分(以碳源为例),考虑到成本：乙酸钠是较为合适的碳源,进一步：乙酸钠的浓度2%比较好,结果：,碳源：乙酸钠 0. 2%,氮源：氯化铵 0.2% 酵母膏0.03%,无机盐: 复合无机盐0.05%,发酵培养基,发酵培养基的设计和优化,正交设计确定优化的配方,发酵培养基的设计和优化,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,种子扩大培
39、养的概念:,种子的扩大培养,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,无杂菌污染,种子扩大培养的目的与要求,种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,斜面 沙土管 冷干管 液氮管,实验室种子制备,生产现场种子制备,生产种子制备的一般流程,菌种保藏,1、斜面 (AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：
40、32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,斜面种子的制备,1.斜面种子：在试管或扁瓶内，以琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。 2. 制备流程： 3. 制备过程注意事项 (1) 琼脂要完全浸没在营养液内,用量1.0%-2.5% ( 2) 营养液中最好不含易沉淀的固形物； (3) 装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3； (4) 灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水 (5) 微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入,影响斜面种子质量的因素,(1)原材料质量，水质，培养基pH， (2)灭菌条件， (3)接种量， (4)培养室温度、湿度、
41、通风、 (5)培养时间， (6)有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯） (7) 冷藏条件,米粒种子（米孢子）,1. 米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。 2 . 米孢子制备工艺流程 3. 制备过程注意事项 （1）浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘连； （2）分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度 （3）米粒不要碰到瓶塞； （4）培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动。 （5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存,2. 一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶
42、中，装液200-250ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,摇瓶种子 1.摇瓶种子 : 将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。 2.制备流程 : 3.制备过程注意事项 培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保持生长过程中pH稳定。 培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50 ml/ 250 ml瓶，60-80 ml/ 500 ml瓶，90-110 ml/
43、750 ml瓶，120-150 ml/ 1000 ml瓶；如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上； 3) 灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上 4） 注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松弛时要紧一紧。 5） 注意摇床中心与边缘、上层与下层的温差,摇瓶种子制备流程,3.质量检查： ( 1) 菌体浓度：外观稠度，静置沉降率，离心沉降率。 ( 2) 菌体生长阶段：显微镜检查细胞分化情况。 ( 3) 代谢情况：对残余糖、氮进行化学分析，并测量pH值。 ( 4) 生产能力：摇瓶发酵试验。 ( 5) 污染杂菌情况：镜检及无菌试验检查,3. 二级种子(种子罐),
44、培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%(10%)）， 32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,种子的质量要求：,108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.887.0-7.2 活力旺盛,五、发酵罐种子 1.制备流程 ： 斜面、摇瓶或米粒种 培养基配制 实罐或连续灭菌 冷却 火圈或压力差接种 培养 发酵罐种子,2 .制备过程注意事项 培养基要求与发酵培养基大致相同，较摇瓶培养基丰富， 控制培养基成份的合理配比， 2) 接种方式： 一级种子罐：火圈保护接种法和压差
45、法 二级种子罐：压差法 3）通气培养时通入空气的温度适中（20-50），搅拌转速也要适当。 4）采用夹套或蛇管冷却以保持恒温，温度不能高于控制温度，防止造成异常发酵 5） 通过培养基中生理酸碱性物质的配比，使pH自然维持在适宜的范围 6）控制合适移种量： 确定合适的移种量：过大或过小都对发酵有不利影响 掌握种子罐的放罐体积。 移种方式：,压差法接种操作示意,质量检查及质量标准： 1）不污染杂菌 2）菌体生长阶段（种龄）：处于对数生长期后期， 菌体量未达到高峰 3）菌体浓度： 菌体浓度的测定方法：离心沉淀法、光密度法、细胞记数法等 4）糖、氮、磷代谢情况 5）种子液pH 6）摇瓶试验的发酵水平
46、7）特异性酶活力,种龄对发酵的影响,种子代谢缓慢原因分析 空气温度偏低 局部烫伤 培养基原材料质量差 培养基灭菌温度太高，营养成分破坏多 无机磷量低 接种量太小 前一级种子质量太差 泡沫多通气差,二、青霉素生产的种子制备,青霉素生产工艺流程 （1）丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管斜面母瓶（25C，孢子培养，7天）大米孢子（26C，种子培养56h,1:1.5vvm）一级种子培养液（27C，种子培养，24h,1:1.5vvm）二级种子培养液（2726C,发酵,7天,1:0.95vvm）发酵液。 （2）球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管（25C，孢子培养，68天）亲米（25C，孢子培养，810天）生产米（
47、28C，孢子培养，5660h,1:1.5vvm）种子培养液（2625-24C，发酵，7天，1：0.8vvm）发酵液,一、斜面孢子,培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天, 注意湿度50%左右,二、大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子,3、一级种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨
48、,4、二级种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,种子的质量要求,菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期,青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，4-6期合成青霉素的能力最强,种子制备的技术概要,一、种子制备的过程,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,二、实验室阶段,1、培养物选择的原则,目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：,对于不产孢子和芽孢的微生物 获得一定数量和质量的菌体,对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。,获得一定数量和质量的孢子,菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁